研究背景：侵袭性骨肿瘤的治疗方法多采用刮除植骨术。此方法主要有两个缺点：一是复发率高,二是填充材料不理想。载药磷酸钙骨水泥系统为这类侵袭性骨肿瘤的治疗,提供了一个良好的选择。磷酸钙骨水泥(calcium phosphate cement, CPC)本身是一种很好的生物填充材料,有良好的塑形性、生物相容性、可吸收性、骨诱导性和骨传导性。此外,CPC还有合适的孔隙率、较大的表面积、快速的凝固时间等优点,这些特点使其成为一种理想的药物载体。载抗生素CPC体系的大量研究已经证明,其在预防和治疗骨髓炎等方面具有良好的作用。这提示：将化疗药物以一定方式加入CPC中,制成载化疗药物的CPC复合物,不仅能修复骨缺损,而且能在局部缓释化疗药物,从而降低肿瘤复发,并减轻化疗的全身系统毒性。在药物和CPC的复合方式中,目前多使用均相包埋方式。该方式是将少量药物粉末与CPC粉末混合后,用固化液调和,使药物均匀地分散在固化体中。优点是：药物的释放有规律,可控制。因此我们选择了这种复合方式。但该复合方式也有缺点：药物被置于骨水泥固化环境中,可以参与CPC的固化反应,从而对材料自身特性产生影响。这些影响可能表现在：固化时间、力学强度、微孔结构、材料降解、成骨活性等方面,而CPC的自身特性也可能影响到所承载药物的缓释性能。因此,我们设想：对化疗药物-CPC复合体的研究应当包括如下若干方面。首先,证明所加入药物并未显著影响CPC的理化特性,如凝固时间、结晶产物以及力学特性等；第二,测定载药CPC复合体的体外药物释放动力学；第三,测定载药CPC复合体的体内药物释放动力学；第四,验证CPC载药后仍然具有降解及成骨活性；第五,评估载药CPC复合体的临床效果。我们选择了甲氨喋呤(Methotrexate, MTX)作为载入药物,制成甲氨喋呤-磷酸钙骨水泥复合体(Methotrexate-loaded Calcium phosphate cement, MTX-CPC).甲氨喋呤是一种常用的抗有丝分裂药物,已经证明对侵袭性肿瘤如骨巨细胞瘤等有效。在前期研究中,针对MTX-CPC,我们设计和进行了一系列体外试验,主要验证了设想的第一和第二点。结果证明：在CPC中载入不同浓度(最高质量比1%)的MTX,不会对CPC的固化时间、晶体结构产生显著影响；当MTX加入量为1%时,CPC轴向压缩强度、横向压缩强度及拉伸强度均明显下降,但材料强度仍符合临床修复非负重骨的要求；MTX-CPC复合体的体外释放符合Higuchi模型,在释放前期有突释效应,随时间延长释放浓度逐渐降低,以稳定浓度释放较长时间,MTX的释放速率与时间的平方根成正比,且药物释放速率与骨水泥厚度及形状无关。为验证试验设想的第三点和第四点,我们设计和进行了如下两部分研究,并将结果报告如下。第一部分甲氨喋呤-磷酸钙骨水泥复合体的体内药物释放研究目的：将甲氨喋呤-磷酸钙骨水泥复合体(MTX-CPC)植入家兔中,检测MTX在局部及外周血中的释放浓度,观察MTX-CPC体内药物释放规律,并与静脉用药相比,观察该复合体能否在维持局部有效浓度的同时,降低血药浓度,从而降低全身毒副作用。方法：预制1%(质量比w／w)的MTX-CPC圆柱形标本(直径3mm,高度1 0mm),标本称重为0.132±0.003 g,每个标本含MTX约1.00±0.02mg。并制作相同体积不含MTX的空白CPC标本作对照。成年新西兰大白兔36只,平均体重2.0±0.2 kg,雌雄不拘,用随机数字表将其随机分为2组。(1)试验组：含兔24只,在右侧股后肌群中制成肌袋,将MTX-CPC植入。(2)对照组：含兔1 2只,在右侧股后肌群中制成肌袋,将空白CPC植入,并由耳缘静脉注射0.1%MTX 1ml.标本处理及观测指标：(1)试验组24只兔：随机分为8组,分别在术后第1、2、5、10、15、20、25、30天各取3只,从耳缘静脉抽静脉血0.5ml,同时从植入部位取出MTX-CPC标本,并取植入物周围0.5 g肌肉组织。血样及肌肉标本经处理后,行高效液相色谱法(hi gh performance liqui d chromatography, HPLC)分别测定外周血及局部的药物浓度。(2)对照组12只兔：随机分为4组,与试验组术后第1、2、5、10天组分别对应(因预实验中,对照组静脉用药后在10天以后已无法测得MTX的血药浓度和局部浓度,设立10天后各组无意义,故仅设立10天前各组与试验组对照),每组于术后第1、2、5、10天各取3只,从耳缘静脉抽静脉血0.5ml,同时从植入部位取出CPC标本,并取植入物周围0.5 g肌肉组织,血样及肌肉标本经处理后,行HPLC法分别测定外周血和局部的药物浓度。(3)根据试验组术后各时间点局部肌肉中的药物浓度,绘制体内药物释放曲线。(4)MTX-CPC中MTX剩余百分比测定：将试验组术后第1、2、5、10、15、20、25、30天各时间点取出的MTX-CPC标本,粉碎后置于100ml去离子水中,经充分释放后,HPLC法测定药物浓度,计算标本中MTX的剩余百分比。(5)全身毒副作用和组织相容性观察：观察各组在试验期内饮食、大小便和刀口愈合情况。取试验组和对照组术后1天、10天时各3只新西兰兔的肝肾标本,HE染色后,观察肝肾毒性。(6)统计分析：统计数据包括试验组和对照组的外周血药浓度、局部药物浓度、标本中MTX剩余百分比,其结果均表达为x±SD。试验组和对照组的外周血药浓度和局部药物浓度的比较应用两样本t-test.数据分析应用SPSS13.0软件,p＜0.05为有显著差异。结果：(1)术后对实验动物的观察：试验期间无异常死亡,未观察到动物饮食及二便异常,所有兔伤口均未感染,未观察到局部坏死或排斥反应,愈合良好。肝肾组织切片结果显示：对照组和试验组在术后1天及1 0天时均无明显肝肾细胞毒性。(2)局部药物释放：MTX-CPC符合均相基质释放体系,在释放前期有突释效应。在第5天时,局部浓度为3.24±0.81μg/ml,而此时对照组浓度仅为0.01±O.00μg／ml,且此后对照组浓度不能测到,两者差别有显著性意义(P＜0.05)。MTX-CPC在前15天内的释放均保持在较高浓度,随后以较稳定速度缓慢释放,第30天时,释放浓度为0.37±0.28μg/ml,仍高于药物最低有效浓度,理论上可释放2-3月。(3)外周血药物浓度：植入5天内试验组MTX血药浓度基本维持在0.04-0.27μg/ml之间,5天后不能测到。该浓度较低,对造血系统及胃肠道粘膜无明显毒性作用。而对照组注射MTX溶液后,血药浓度在1天时即达到1.03±0.12μg/ml,是同期试验组血药浓度的4倍左右,两者相比差别有显著性意义(P＜0.05)。此后MTX浓度迅速降低,5天时与试验组相近,5天后不能测到。(4)MTX-CPC中的MTX剩余百分比：经过第1天释放后,标本中剩余MTX约86.65±1.27%,释放15天后剩余26.78±5.97%,至第30天时仅剩余约13.45±6.52%。结论：载MTX的CPC复合体对于治疗侵袭性骨肿瘤来说是一个有效的缓释系统。1. MTX-CPC的局部释放符合均相基质释放体系,在释放前期有突释效应,随后以较稳定速度缓慢释放。2. MTX-CPC可在维持有效浓度的基础上长期、稳定释放。3. MTX-CPC释出的MTX在局部组织中浓度高而血药浓度低,与静脉用药相比,在维持局部浓度的同时,可降低化疗药物的全身毒副反应。第二部分甲氨喋呤-磷酸钙骨水泥复合体的体内降解及成骨活性研究目的：MTX在局部抑制肿瘤细胞生长的同时,可能会对材料吸收降解及正常骨形成过程产生影响。本研究的目的在于：将MTX-CPC植入动物体内,观察材料降解和骨生成的过程,并与空白CPC对照,观察MTX的局部释放是否对材料降解和成骨过程产生影响。方法：预制1%(质量比w/w) MTX-CPC圆柱形标本(直径3mm,高度l Omm)。标本称重为0.132±0.003 g,每个标本含MTX约1.00±0.02mg。并制作相同体积不含MTX的空白CPC标本作对照。成年新西兰大白兔24只,平均体重2.0±0.2 kg,雌雄不拘。按随机数字表随机分为2组(CPC组和MTX-CPC组),每组12只兔。于每只兔左股骨外髁上约2cm处钻孔,将预制的CPC或MTX-CPC标本植入。术后1天、1月、3月、6月,每组分别处死3只兔子,以植入部位为中心,取得股骨标本。标本处理及检测指标：(1)将取得的股骨标本拍摄X片,观察植入材料的密度变化。(2)将股骨标本固定、脱钙、脱水、包埋、切片。(3)股骨标本HE染色：观察成骨情况,并测量新成骨面积(New bone volume. NBV).(4)股骨标本免疫组织化学及酶组织化学染色：观察碱性磷酸酶(ALPase)阳性的成骨细胞和抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAPase)阳性的破骨细胞活动,了解材料降解和成骨情况,并测量每视野成骨细胞数量,即成骨细胞指数(Osteoblast index,OBI)和每视野破骨细胞数量,即破骨细胞指数(Osteoclast index,OCI).(5)统计分析：统计数据包括NBV.OBI和OCI,结果均表达为x±SD,数据分析应用SPSS13.0软件,均数的比较应用两样本t-test,p<0.05为有显著差异。结果：(1)X线分析：植入CPC和MTX-CPC标本密度的变化表明两者均有降解性。植入6月后,较植入初期相比,CPC和MTX-CPC密度均明显降低,表明部分材料降解,骨缺损得到初步修复,但仍可见高密度的材料残留。(2)短期植入(1天及1月)组织学观察：CPC组植入1月时可见少量TRAPase(+)破骨细胞开始吞噬CPC,并有ALPase(+)成骨细胞贴附于骨壁,有少量新生骨基质形成,造成骨壁边缘不规则。MTX-CPC在植入1天时可见与骨壁清晰的圆形边界,无炎性细胞反应；植入1月时MTX-CPC的体积和形态与植入1天时相比没有明显改变,新生骨基质明显少于同时期CPC组。(3)长期植入(3月及6月)组织学观察：CPC组植入3月时,可见较多的新骨和骨芽形成,自周边向CPC中央长入；在植入6月时,新成骨逐渐填充整个CPC,仅剩余中心部分CPC,新成骨类似松质骨结构,大量的破骨细胞聚集于CPC表面,而成骨细胞位于破骨细胞后方,两者形成偶联结构。MTX-CPC组在植入6月时,与同时期CPC相似,新成骨逐渐填充整个材料,仅剩余中心部分CPC,也可见大量破骨细胞与成骨细胞形成的偶联结构。(4)组织形态学定量分析(NBV.OBI.OCI测量)：植入1月时CPC组的NBV约3.98±0.31%,明显高于MTX-CPC组2.08±0.46%(P=0.004)；CPC组的OBI和OCI也明显高于MTX-CPC组(P=0.038,P=0.034)。植入3月时CPC组和MTX-CPC组NBV分别达到18.17±3.73%和16.51±2.33%,两者之间无显著差异；两组之间OBI也无明显差异；但CPC组OCI仍显著高于MTX-CPC组(P=0.049)。植入6月后,CPC组和MTX-CPC组NBV分别达到38.20±6.87%和36.94±2.30%,两者之间无显著差异；两组之间OBI和OCI也无显著差异。结论：MTX-CPC有良好的降解和成骨活性,在填充骨肿瘤导致的骨缺损方面是一种很好的人工材料。1. MTX-CPC与空白CPC相比,仍具有良好的降解性和成骨活性。2.在MTX-CPC和CPC的降解和新骨形成过程中,成骨细胞和破骨细胞起到了重要的介导作用。3.MTX-CPC中释放的MTX会对细胞介导的降解和成骨过程产生抑制作用,但随着时间延长,抑制作用逐渐降低,局部释出的MTX对材料的长期吸收和成骨不会产生显著影响。