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研究背景:骨质疏松(Osteoporosis,OP)是一种全身性的骨骼退行性病变,以骨量减少和骨显微结构退变为主要特征,引起骨脆性提高,骨强度下降,骨折风险增加。骨质疏松发病率高,并发症严重,资源消耗大,给患者本人及家庭和社会造成沉重负担,已成为全球性的健康问题。其中,中老年女性由于骨量峰值较低和绝经后雌激素水平显著下降,很容易发生绝经后骨质疏松(Postmenopausal Osteoporosis,PMO)。目前临床上应用的抗骨质疏松药物,虽然可以取得一定疗效,但是均属替代治疗,且费用昂贵,对于庞大的患病人群,尤其是发展中国家,是一笔沉重的负担,长期用药还会造成患者依从性差,药物不良反应的发生率增加。因此,研发新的更加经济、安全、有效的抗骨质疏松药物已成为当前医学研究领域最活跃的课题之一。中药在治疗骨质疏松方面,具有整体调节、毒副作用小、价格低廉等优点,已引起国内外研究者的广泛关注。其中据文献报道,中药藏红花(Crocus Sativus)可能通过抗氧化、抗炎途径,具有潜在的抗骨质疏松作用。研究目的:研究中药藏红花主要单体成分藏红花素(Crocin)对去卵巢大鼠骨质疏松模型的影响和对体外培养大鼠成骨细胞增殖、分化和凋亡的作用,并探讨其机制,为其临床应用提供实验基础。研究方法:1、动物实验:采用去势大鼠建立绝经后骨质疏松模型。将60只3月龄SD雌性大鼠随机分为6组(n=10):假手术组(Sham)、模型组(OVX+生理盐水)、雌激素组(OVX+雌二醇,25ug/kg/d)、藏红花素低剂量组(OVX+Crocin,5mg/kg/d)、中剂量组(OVX+Crocin,10mg/kg/d)、高剂量组(OVX+Crocin,20mg/kg/d)。术后4周开始连续灌胃,持续给药16周后处死大鼠,获得大鼠血清、尿液、股骨及椎体标本,称取子宫湿重,计算子宫指数(Index of Uterus,IU)。然后通过双能X线吸收骨密度仪(Dual Energy X Ray Absorptiometry,DEXA)测定腰四(L4)椎体和股骨骨密度(Bone Mineral Density,BMD);将股骨置于生物力学实验机(MTS 858 Mini Bionix II)进行三点弯曲实验,通过载荷-位移曲线计算出生物力学参数;应用显微CT(Micro-CT,GE Healthcare,USA)扫描L4椎体,评价骨小梁显微结构;采用全自动生化分析仪(Ciba-Corning 550,USA)测量血钙、血磷、碱性磷酸酶(ALP)、骨钙蛋白(OC)、尿钙、尿磷、尿肌酐值;使用黄嘌呤氧化酶(XO)法和硫代巴比妥酸(TBA)法测定血清中超氧化物歧化酶(SOD)活性与丙二醛(MDA)含量。2、细胞实验:采用“胰酶消化+骨组织块贴壁法”体外培养大鼠成骨细胞,通过碱性磷酸酶染色和茜素红钙结节染色对成骨细胞进行鉴定,传代培养至第3代成骨细胞后,开始进行实验干预:(1)细胞增殖实验:将第3代细胞随机分为4组:对照组、藏红花素低剂量组(1mmol/L)、中剂量组(2mmol/L)、高剂量组(4mmol/L)。采用噻唑蓝比色法(MTT)检测细胞增殖情况,应用硝基苯磷酸(PNPP)法检测细胞裂解液中ALP的活性。(2)细胞凋亡实验:将第3代细胞随机分为5组:对照组;TNF-α组(30ng/ml);藏红花素低剂量组(1mmol/L)+TNF-α;中剂量组(2mmol/L)+TNF-α;高剂量组(4mmol/L)+TNF-α。24小时后利用分光光度法测定细胞裂解液中的凋亡相关酶Caspase-3的酶活性,利用流式细胞仪检测细胞凋亡率,使用黄嘌呤氧化酶(XO)法和硫代巴比妥酸(TBA)法测定细胞裂解液中SOD活性与MDA含量。研究结果:1、动物实验:与OVX组相比,藏红花素治疗组椎体和股骨骨密度下降的趋势得到有效抑制(P<0.05);股骨三点弯曲最大载荷、最大应力、杨氏模量均显著增高(P<0.05);L4椎体松质骨骨小梁显微结构明显改善(P<0.05);骨生化指标血清ALP、血清OC、尿钙/肌酐、尿磷/肌酐测定值明显下降(P<0.05);藏红花素有助于提高OVX大鼠血清SOD活性(P<0.05),降低脂质过氧化产物MDA含量(P<0.05)。2、细胞实验:经细胞鉴定,本实验方法能够培养出纯度较高、满足实验要求的成骨细胞。(1)细胞增殖实验:与对照组相比较,藏红花素中、高剂量可提高成骨细胞增殖率(P<0.05),提高ALP活性(P<0.05);(2)细胞凋亡实验:与TNF-α组相比,藏红花素中、高剂量组能够有效抑制凋亡关键酶Caspase-3活性(P<0.05),降低细胞凋亡率(P<0.05);能够提高细胞裂解液中SOD活性(P<0.05),降低MDA含量(P<0.05)。研究结论:藏红花素能够抑制去卵巢大鼠骨量丢失,提高骨生物力学强度,改善松质骨骨小梁显微结构,改善骨代谢,降低骨转换率;可以促进体外培养大鼠成骨细胞的增殖,抑制TNF-α诱导的成骨细胞凋亡。藏红花素对骨质疏松具有一定的治疗作用,其作用机理可能与抗氧化、抗炎效应有关,具体机制还有待进一步实验研究。