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近年来，innexin基因的研究获得了越来越多的关注，其功能主要集中在胚胎发育、形态发生和电突触形成等方面。然而，该基因还有许多重要的生物学功能亟待阐明。随着国内外对拟穴青蟹（Scylla paramamosain）细菌性病原诱导产生响应的功能基因的研究逐渐增多，本实验室也在前期研究工作中，利用抑制性消减杂交技术从LPS刺激的拟穴青蟹血淋巴细胞中分离获得了上调表达的Sp-inx2基因的部分序列(Chen et al.，2010)。在克隆Sp-inx2基因的过程中，又发现了innexin基因家族的另一成员Sp-inx3。本论文比较系统地研究了Sp-inx2和Sp-inx3的基因结构特点、组织器官分布特性及细胞内定位，Sp-inx2蛋白组成的半通道的基本特征及其在弧菌诱导和LPS刺激后的表达模式，并通过体外培养拟穴青蟹原代血淋巴细胞以及借助异源表达Sp-inx2基因的细胞系，初步探讨了Sp-inx2在免疫、代谢及在促细胞凋亡中发挥的作用。该项研究为初步阐明Sp-inx2基因的功能并为探讨Sp-inx2基因潜在的应用价值奠定了理论基础。取得的结果如下: 1.克隆获得拟穴青蟹innexin基因家族成员Sp-inx2和Sp-inx3的全长cDNA序列。Sp-inx2的全长cDNA序列包括1080bp的开放阅读框(Open reading frame，ORF)（GenBank登录号:FJ774668.1）。预测该基因编码359个氨基酸，编码的蛋白分子量为42kDa。Sp-inx3的全长cDNA序列包括1104bp的ORF，预测其编码367个氨基酸，编码的蛋白分子量为42kDa。阐明了Sp-inx2的基因组DNA结构，包含5个外显子和4个内含子，并通过基因组步移技术获得Sp-inx2基因组DNA5侧翼序列，长度为870bp。 2.获得了Sp-inx2和Sp-inx3 C-末端原核表达产物并制备了特异性抗体。根据Sp-inx2和Sp-inx3基因的cDNA序列C-端150bp，构建了pET-28a(+)/Sp-inx2和pET-28a(+)/Sp-inx3融合表达载体，在大肠杆菌中诱导表达出重组蛋白。利用纯化好的目的蛋白制备了特异性强、效价高的多克隆抗体，可以用于后续蛋白功能的相关研究。 3.阐明了Sp-inx2和Sp-inx3基因的组织表达特性以及在不同发育阶段的表达模式。结果表明Sp-inx2和Sp-inx3基因均在各组织器官中表现出组成型表达的特点，其中Sp-inx2基因在血淋巴细胞中表达量最高;Sp-inx3基因在眼柄、脑神经节和胸神经团中表达水平较高。在特定组织中的高表达量预示着具有的潜在功能。伴随着青蟹的早期发育进程，Sp-inx2基因表达量逐渐升高，在溞状幼体Ⅰ期表达量最高;Sp-inx3基因在青蟹发育早期表达量较高，但随着生长发育进程其表达量逐步降低。 4.研究了Sp-inx2蛋白和Sp-inx3蛋白在拟穴青蟹部分组织器官中的分布特征。通过改变蛋白加热变性的温度、改用变性剂DTT及Urea-SDS-PAGE电泳技术等方法，成功将innexin蛋白多聚体解聚为innexin蛋白单体。各选取了代表性的组织器官，利用Western blotting技术研究了Sp-inx2和Sp-inx3的蛋白表达模式。Sp-inx2蛋白在血淋巴细胞中表达量最高。Sp-inx3蛋白则在眼柄、脑神经节和胸神经团中表达量较高。此外，利用细胞免疫荧光方法重点研究了原代培养的拟穴青蟹血淋巴细胞中Sp-inx2蛋白的细胞定位，发现Sp-inx2充满了血淋巴细胞的细胞质;利用免疫组化技术发现Sp-inx3蛋白广泛分布于青蟹胸神经团和脑神经节中。 5.用溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）、副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）人工感染及LPS刺激，发现Sp-inx2在青蟹免疫器官中诱导表达:溶藻弧菌感染的拟穴青蟹血淋巴细胞、鳃和肝胰腺中Sp-inx2基因转录水平显著升高(p＜0.05);副溶血弧菌感染的拟穴青蟹中肠和鳃中Sp-inx2基因转录水平显著上升(p＜0.05);LPS刺激后拟穴青蟹血细胞、中肠和肝胰腺中Sp-inx2基因转录水平明显升高(p＜0.05)。此外，分析了原代培养的血淋巴细胞在LPS刺激下，Sp-inx2基因的响应情况，结果表明，200μg·mL-1的LPS刺激会诱导Sp-inx2上调表达。 6.初步发现拟穴青蟹血淋巴细胞中存在半通道（hemichannel）:为探讨是否innexin蛋白形成细胞膜通道，本研究在血淋巴细胞培养中使用通道常用的特异抑制剂生胃酮和丙磺舒，结果发现这些抑制剂可导致血淋巴细胞对荧光染料荧光黄的吸收率下降，预示拟穴青蟹血细胞中半通道的存在。此外，分析了Ca2+和Mg2+对拟穴青蟹血淋巴细胞吸收荧光染料的影响，结果发现这两种金属离子未对血细胞吸收染料发生显著性影响。用Western botting和细胞免疫荧光技术，发现pCMV-HA-Sp-inx2质粒转染后，HeLa细胞从24h到96h持续表达Sp-inx2蛋白，且在72h开始吸收荧光黄染料，进一步试验观察到该荧光染料的摄取可以被生胃酮和丙磺舒这两种抑制剂有效的抑制。 7.LPS刺激影响innexon半通道的开闭:分析了LPS刺激和innexon通道开闭的关联性。LPS刺激体外培养拟穴青蟹原代培养血淋巴细胞，尽管Sp-inx2mRNA水平和蛋白水平均同时渐增，但血淋巴细胞半通道对荧光黄染料的吸收率却显著降低(p＜0.05);预示了LPS对半通道innexon的调控作用。异源表达Sp-inx2蛋白的HeLa细胞，其染料吸收率也因LPS的刺激而显著降低(p＜0.05)。 8.分析了innexon通道和ATP释放的关系。LPS刺激血淋巴细胞6h能一定程度地阻止ATP释放到胞外环境中。然而，HeLa细胞异源表达Sp-inx2，未发现其能促进ATP的释放。 9.异源表达的Sp-inx2可特异性诱导某些类型的细胞凋亡:Sp-inx2 siRNA处理组与对照组相比，拟穴青蟹血淋巴细胞的凋亡数量未发生显著变化(p＞0.05)。人胚肾293T细胞(human embryonic kidney293T cells，HEK293T)、中国仓鼠卵巢细胞（Chinese hamster ovary cells，CHO）和小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryofibroblasts，MEF)异源表达Sp-inx2后，通过TUNEL方法没有检测到促细胞凋亡现象发生。鲤鱼上皮瘤细胞(Epithelioma papulosum cyprini，EPC)和人宫颈癌细胞(human cervical cancer cells，HeLa)异源表达Sp-inx2后，均呈现出自发性的细胞凋亡。此外，当HeLa细胞转染pCMV-HA-Sp-inx2质粒，24h细胞表现出细胞凋亡现象时，发现其线粒体膜电位未发生变化，推测细胞凋亡可能是由线粒体膜电位变化之外的原因引起的。