定向、共价固定化技术是通过引入特殊融合标签进行蛋白质固定化的技术,能够避免酶蛋白分子直接参与反应,维持酶活性中心的构象,因此,该技术有望克服传统工艺的技术难点,推动固定化酶大规模应用于生产实践。本研究在共价结合法的基础上利用某些特殊的化学反应和生物修饰,实现对蛋白质(酶)的有序、定向固定化,以尽量减少固定化对目的蛋白空间结构、活性位点可能造成的影响,为探索新的蛋白质(酶)特异性定向、共价固定化技术方法提供理论依据,为固定化蛋白质(酶)工业化生产的进一步普及奠定基础。本实验利用商业化的巯基蛋白琼脂糖偶联树脂作为载体,利用荧光蛋白作为模式蛋白构建融合表达载体,并利用大肠杆菌表达系统大量表达,纯化后得到SRP-GFP或ACP-X蛋白(X表示GFP或mCherry),经3,4-二溴马来酰亚胺将巯基封闭后,再巧妙利用Sfp对其识别位点SRP或ACP进行磷酸泛酰巯基乙胺修饰,通过修饰所得的游离巯基介导目的蛋白与载体共价结合,进而建立起一整套新的蛋白质固定化以及多蛋白共固定化方法体系。本实验对目的蛋白固定化前的修饰过程及固定化的动态过程进行了探究,通过蛋白浓度测定、荧光强度分析等方法确定不同融合蛋白的固定化量。实验结果表明,作为融合标签,ACP不仅能够有效促进目的蛋白的可溶性表达,还能够实现蛋白的定向共价固定化,其中ACP-GFP和ACP-mCherry的饱和固定化量分别达到8.67 mg/mL和8.78 mg/mL。将ACP-GFP和ACP-mCherry混合后,共同固定的结果显示,当两者分别以3∶1、1∶1和1∶3比例的量加入固定化体系,经检测发现,得到的固定化蛋白中,两者含量也分别以3∶1、1∶1和1∶3的比例被固定化,说明利用4’-PP修饰的蛋白质定向、共价固定化方法在多酶共固定化研究中也有着广阔的应用前景。综上所述,本实验成功实现了蛋白质共价、定向固定化及多蛋白共固定化的方法体系建立,有利于推进固定化蛋白质在工业化生产中的广泛应用。