microRNAs(miRNAs)是一类在物种间高度保守的单链小分子非编码RNA,通常与其靶基因m RNAs的3’-UTR区域结合而导致m RNAs降解或影响其翻译。骨骼肌发育是一个高度复杂的生物学过程,其需要大量调控因子的参与,包括miRNA。对不同年龄的猪骨骼肌高通量测序发现miR-204-5p的表达随着年龄的增长而逐渐降低,但miR-204-5p影响骨骼肌发育的具体机制很少被报道。本实验运用小鼠C2C12细胞作为研究对象,通过过表达或抑制表达miR-204-5p来探究miR-204-5p对成肌细胞增殖和分化的影响作用。并进一步通过双荧光素酶报告系统和小干扰RNA技术验证了miR-204-5p的靶基因,及其调控肌生成相关的分化和肌纤维转换等过程。研究结果如下:(1)随着小鼠年龄的增长,miR-204-5p在骨骼肌中的表达逐渐下降。miR-204-5p在C2C12细胞自然增殖到分化这个过程中也逐渐下调。(2)运用细胞增殖分析的CCK-8和Ed U试剂盒以及RT-q PCR技术发现miR-204-5p能够显著抑制细胞的增殖,并且Ed U阳性细胞率和细胞周期相关基因的表达显著降低(p<0.01)。(3)C2C12细胞分化期,通过明场图观察和肌球蛋白My HC免疫荧光染色发现miR-204-5p显著抑制了肌管的生成,并且My HC阳性细胞比例显著减少(p<0.01)。RT-q PCR技术发现miR-204-5p显著抑制了肌源性分化标志基因的表达(p<0.01)。(4)miR-204-5p能够显著减少My HC的四种亚型表达,其中慢肌(My HCI)减少的最为显著(p<0.01)。肌球蛋白My HCI的免疫荧光染色证明miR-204-5p显著抑制了慢肌的生成。(5)通过对C2C12细胞线粒体染色和相对线粒体DNA含量分析发现miR-204-5p能够显著抑制线粒体生成(p<0.05)。(6)双荧光素酶报告系统验证的结果证明MEF2C和ERRγ是miR-204-5p的直接靶基因。通过干扰MEF2C或ERRγ的表达显著抑制了肌管和慢肌的生成(p<0.01)。并且,在细胞中同时干扰靶基因和转染miR-204-5p mimics的双处理组对于肌管和慢肌生成能力的抑制效应显著高于只干扰靶基因的处理(p<0.01)。上述研究结果表明miR-204-5p能够负调控C2C12细胞的增殖和分化,并且影响肌纤维类型的转换和线粒体生成。miR-204-5p通过直接靶向MEF2C和ERRγ调控肌生成相关的分化和肌纤维转换等过程。这些研究表明miR-204-5p是肌生成过程中的一种表观调控因子,为肌肉发育的表观遗传调控研究提供了基础数据。