论文部分内容阅读
随着实体器官移植的发展,对于缺血／再灌注(I/R)损伤的研究已经涉及到了大部分常见的移植器官,如肝脏、肾脏、胰腺和肺等。I/R损伤与器官移植中移植器官原发性无功能(PNF)的发生及移植器官的生存时间密切相关。I/R损伤再灌注期包含两个阶段：急性期和亚急性期。急性期主要表现为移植器官细胞的损伤(再灌注后3-6 h),亚急性期主要表现为大量中性粒细胞的浸润(再灌注后18-24 h)。在肝脏I/R损伤的急性期,主要是肝脏巨噬细胞(枯否细胞,Kupffer cells)产生的一系列活性氧(ROS)直接造成组织损伤并引起一系列有害的细胞反应,从而导致炎症、细胞死亡和器官衰竭。这说明枯否细胞产生的ROS及作为其主要来源的NADPH氧化酶在I/R损伤中扮演了重要的角色。单核巨噬细胞在免疫系统中是非常独特的细胞,它们通过黏附在血管内皮上,穿过血管膜并在炎症部位聚集的方式在体内移动。相当多的证据表明枯否细胞作为一种肝脏内特异性的巨噬细胞,对于肝脏的损伤起关键作用。通过内毒素直接或间接激活的枯否细胞可以引起一系列炎症介质和ROS的释放,而枯否细胞的失活则能够减轻肝脏的损伤。炎症反应和ROS的生成对于清除细菌、病毒和寄生虫等病原微生物至关重要,然而过多和过久激活炎症反应对于宿主却是有害的。研究表明表面受体整合素CD11b/CD 18 (也称为macrophage-1 Ag,Mac-1)作为一种病原识别受体(PRR),可以识别病原体相关分子模式(PAMPs)和损伤相关分子模式(DAMPs),如革兰氏阴性细菌来源的脂多糖(LPS),淀粉样p蛋白(p-amyloid)和高迁移率族蛋白1(HMGB1).而Mac-1的配体结合能力可能是由CD11b亚基中的A结构域的固有性状所决定的,这就提示CDllb对于Mac-1在宿主防御中起到关键作用。在体内,CD11b是表达在吞噬细胞表面的主要整合素,介导吞噬细胞游出至炎症器官及对血清调理的病原体的吞噬作用,包括产生ROS,释放细胞因子和细胞毒性颗粒。然而,CD11b在枯否细胞中的作用及其分子机制仍没有得以阐明。在本实验中,我们研究了CD11b和枯否细胞在肝脏I/R损伤中的作用、关系及其机制。首先我们建立稳定、可靠的小鼠70%肝脏I/R损伤模型,通过检测小鼠术后的生命体征、精神状态变化情况及生存时间,确定最佳的I/R模型。然后,我们利用CD11b缺陷(C57BL/6背景,CD11b-/-)小鼠和野生型(C57BL/6,WT)小鼠验证了CD11b在肝脏I/R中的作用及其效应细胞。在此基础上,我们进一步探索了CD11b参与肝脏I/R损伤的机制。一、小鼠70%肝脏I/R损伤模型的建立目的：建立稳定、可靠的小鼠70%肝脏I/R损伤模型。方法：以C57BL/6小鼠作为实验对象,分为假手术(sham)组和不同缺血时间的3组,每组5只,分别用无损显微血管夹阻断肝脏左叶和中叶血流50、60和70 min,然后松开血管夹,恢复肝脏左叶和中叶血流,最后缝合腹部切口。术后10 d观察小鼠体重、有无厌食、精神状态等体征,并比较各组生存时间和组织病理学变化。结果：50 min组小鼠体重减轻最小,无厌食,精神状态最佳,存活时间也最长,但肝脏组织病理学损伤程度也最轻；70 min组小鼠体重减轻最多,厌食最严重,精神状态最差,存活时间最短,全部在3d内死亡；60 min组小鼠各项指标居中,最短生存时间为5天,表现出较明显的组织损伤。结论：本研究中70%肝脏I/R模型的缺血时间为60 min较合适。二、CDllb在肝脏I/R损伤中的作用及其机制研究目的：探索CD11b对肝脏I/R损伤的影响及其机制。方法：将体重相近(20-25g)的10只CDllb-/-小鼠和10只C57BL/6小鼠分别随机分为CD11b-/- sham组、CD11b-/-、WT sham组和WT组,每组5只。再灌注后不同时间点(1、3、6、12、24、48 h)取血液检测转氨酶(ALT、AST),肝组织样本行HE染色和凋亡检测,TRIzol试剂盒一步法提取肝组织细胞总RNA,检测肝组织中TNF-a, IL-1β, IL-6, IL-8和IL-10的mRNA表达情况。检测脂质过氧化终产物丙二醛(MDA)和谷胱甘肽(GSH/GSSG比率),确定各组小鼠的氧化应激情况。然后用GdCl3清除C57BL/6小鼠枯否细胞并以免疫荧光检验清除效果,同时检测再灌注3h后小鼠转氨酶和TNF-a,明确枯否细胞的作用。检测各组小鼠NADPH氧化酶活性和ROS产生情况,明确CDllb对肝I/R损伤的作用途径。免疫印迹(Western blot)检测p47phox及Src激酶,明确CDl1b调控信号通路。免疫共沉淀(Immunoprecipitation)检测Src与p47phox之间的关系。最后使用Src抑制剂PP2预处理枯否细胞,石蜡油体外模拟I/R,检测NADPH氧化酶活性,ROS产生及Src与p47phox表达情况的变化。结果：ALT、AST在3h达到峰值且CDllb-/-著低于WT小鼠,以后逐渐下降,至48 h后恢复到正常水平。肝组织HE染色显示CD11b-/-小鼠肝细胞坏死、充血和肿胀程度明显轻于WT小鼠,凋亡检测显示凋亡细胞数量也比WT小鼠少。CDllb-/-小鼠TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8表达低于WT小鼠,而IL-10表达却高于WT小鼠。CD11b-/-小鼠I/R后MDA浓度显著低于WT小鼠,而GSH/GSSG比率显著高于WT小鼠。GdCl3清除枯否细胞后GdCl3处理组和CDllb-/-组的小鼠I/R后ALT和AST水平及TNF-a表达水平明显低于未使用GdCl3组的WT小鼠。CD11b-/-小鼠的NADPH氧化酶活性及ROS产生也低于WT小鼠。进一步检测显示,CD11b-/-小鼠枯否细胞中p47phox磷酸化水平在再灌注3h后显著低于WT组小鼠,且p47phox与Src激酶相结合。使用PP2后体外模拟I/R,小鼠NADPH氧化酶活性下降,ROS产生减少,且p47phox与Src激酶磷酸化水平均降低。结论：枯否细胞上的整合素CD11b能够调控肝脏I/R损伤,尤其是在再灌注的早期阶段。而且,我们发现CDllb的调控作用是依赖Src激酶的,通过Src-p47phox磷酸化途径从而影响NADPH氧化酶激活,最终影响ROS的产生。抑制CD11b有可能成为防治肝移植手术中I/R损伤的新的治疗方向。