细胞凋亡不但在肿瘤发生发展过程中起着重要作用，而且在肿瘤的化疗和复发方面也扮演着重要角色，恶性肿瘤细胞抑制凋亡是促使其发生耐药、转移的关键环节。由线粒体介导的内源性凋亡通路是哺乳动物细胞程序性死亡的主要途径。细胞在受到诸如DNA损伤、细胞周期阻滞、失粘附和缺氧等的凋亡刺激时，可导致位于线粒体内的与凋亡相关的活性物质被释放出来介导细胞凋亡，这些活性物质有细胞色素C、凋亡诱导因子(apoptosis inducing factor，AIF)、核酸内切酶G(EndoG)和Bit1(Bcl-2 inhibitor of transcription)等，其中，由AIF和Bit1介导的凋亡是caspase(半胱氨酸蛋白酶)非依赖性的凋亡。AIF是一类在进化上保守的黄素蛋白，也是一种新型的凋亡诱导蛋白，定位于线粒体内外膜间隙中，它既能诱导细胞的凋亡，也具有氧化还原酶的活性。Bit1和AIF一样定位于线粒体，在胞浆内与AES(amino-terminal enhancer of split，AES)结合可介导失黏附所引发的离巢凋亡，其正常的生理功能尚不清楚。目前，仅有少量文献报道AIF和Bit1的表达与肿瘤发生发展的关系，至于AIF和Bit1与食管癌的关系国内外未见报道。p63是p53家族新成员，由于有两个启动子，它可编码功能相反的异构体：包含转录激活结构域的TA型和缺少转录激活结构域的ΔN型。又由于转录后C-端的不同剪切，TA型和ΔN型分别有α、β和γ三种亚型。研究发现，在食管鳞癌中，p63的上调可能对鳞癌的形成起了重要作用，进一步研究发现食管鳞癌中p63的表达亚型是ΔNp63而不是TAp63，ΔNp63的高表达可能是食管鳞癌的早期事件，并对食管鳞癌的进展发挥重要的作用。TA型同源体由于在DNA结合区与p53有60％的同源性，可以结合p53同源序列并诱导p53靶基因的转录，如p21、Bax和MDM2等，在这方面，TAp63γ同源体表现出较强的活性，可以诱导肿瘤细胞周期抑制和发生凋亡，但其诱导凋亡机制不清。因此本研究试图通过研究AIF和Bit1在食管鳞癌中的表达及其在TAp63γ诱导细胞凋亡中的作用，来探讨AIF和Bit1在食管鳞癌发生发展中的作用，并对TAp63抑制肿瘤的分子机制进行初步了解，同时也为将AIF和Bit1应用于肿瘤杀伤提供实验依据。本研究拟从以下几个方面进行研究：第一，采用免疫组织化学法检测食管鳞癌组织、不典型增生组织和正常食管黏膜组织中AIF和Bit1的表达；第二，利用分子生物学常规技术检测食管鳞癌细胞系EC9706和Eca109细胞中AIF和Bit1的表达及p63的表达亚型；第三，采用真核细胞转染技术、细胞凋亡检测技术检测TAp63γ基因表达对EC9706细胞的周期分布及凋亡的影响；第四，利用激光共聚焦显微镜、亚细胞器分离、RNA干扰等分子生物学技术来探讨AIF和Bit1在TAp63γ诱导细胞凋亡中的作用。本研究分为以下四个部分。第一部分食管鳞癌组织、不典型增生组织及正常食管黏膜中AIF和Bit1基因表达的研究方法1．采用免疫组化法对49例活检标本包括19例早期食管鳞癌、20例不典型增生以及10例正常食管黏膜标本中AIF和Bit1蛋白表达情况进行检测。2．采用免疫组化法对35例中晚期食管鳞癌手术标本及其配对的正常食管黏膜标本中AIF和Bit1蛋白表达情况进行检测。3．采用SPSS13.0统计软件对数据进行X~2检验，检验水准α=0.05。结果1 AIF在早期癌、异型增生和正常食管黏膜中的过表达率分别为84.21％(16／19)、75％(15／20)和40％(4／10)；AIF在早期癌中的过表达高于正常食管黏膜(P＜0.05)，与不典型增生相比无明显差异(P＞0.05)；AIF在不典型增生中的过表达与正常食管黏膜相比无明显差异(P＞0.05)。2 Bit1在早期癌、异型增生和正常食管黏膜中的阳性率分别为78.94％(15／19)、80％(16／20)和40％(4／10)，Bit1在不典型增生中的阳性表达比正常食管黏膜高(P＜0.05)；Bit1在早期癌的阳性表达与不典型增生、正常食管黏膜相比均无显著性差异(P＞0.05)。3 AIF在中晚期食管癌和癌旁正常食管黏膜中的过表达率分别为80％(28／35)和45.71％(16／35)，AIF在中晚期食管癌中的过表达高于正常食管黏膜(P＜0.05)。在食管鳞癌组织中，AIF基因的蛋白表达水平与临床分期及患者性别无明显相关(P＞0.05)。4 Bit1在中晚期食管癌和癌旁正常食管黏膜中的阳性率分别为37.14％(13／35)和40％(14／35)，Bit1在二者中的阳性表达无显著性差异(P＞0.05)。在食管鳞癌组织中，Bit1基因的蛋白表达水平与患者性别无明显相关(P＞0.05)；Bit1的表达在不同的食管鳞癌临床分期中差异有显著的统计学意义，在早期癌中的表达高于中晚期癌(P＜0.05)。第二部分食管鳞癌细胞系中AIF和Bit1的表达及p63的表达亚型鉴定方法1采用RT-PCR检测食管鳞癌细胞细胞系EC9706和Eca109细胞中Bit1、AES、TAp63和ΔNp63的mRNA表达水平。2采用免疫细胞化学法和Western Blotting检测两种食管鳞癌细胞中AIF、Bit1的蛋白表达。结果1 RT-PCR结果表明EC9706和Eca109细胞中Bit1、AES和ΔNp63在mRNA水平得到了表达，而TAp63不表达，说明p63的表达亚型是ΔNp63。2免疫细胞化学结果显示AIF与Bit1在EC9706和Eca109细胞中表达阳性，且定位在细胞质。Western Blotting结果表明：与内对照β-actin蛋白及阳性对照HeLa229细胞中的表达相比较，两种细胞系中均存在高水平表达的AIF与中等表达水平的Bit1蛋白。第三部分TAp63γ基因表达对EC9706细胞的周期分布及凋亡的影响方法1将对照质粒pcDNA3.1-GFP，在同样条件下转染到EC9706细胞中，并通过荧光显微镜观察质粒pcDNA3.1转染EC9706细胞的效率。2 EC9706细胞在分别转染质粒pcDNA3.1-TAp63γ、pcDNA3.1／Myc-His-TAp63γ和pcDNA3.124小时后，收集细胞提取总RNA，RT-PCR扩增TAp63γ基因。3 EC9706细胞在分别转染质粒pcDNA3.1／Myc-His-TAp63γ、pcDNA3.1-p53和pcDNA3.1 24小时后，提取细胞总蛋白，用p53抗体和组蛋白标签抗体及β-actin抗体进行Western Blotting分析转染后TAp63γ在蛋白水平的表达及转染前后p53蛋白的表达。4 pcDNA3.1、pcDNA3.1-TAp63γ分别转染EC9706细胞24h、48h后，采用流式细胞仪检测TAp63γ基因表达对EC9706细胞周期分布的影响。5 EC9706细胞分别转染pcDNA3.1、pcDNA3.1-TAp63γ和pcDNA3.1-p53 24h后，采用抽提细胞DNA Ladder法检测凋亡。6 EC9706细胞分别转染pcDNA3.1和pcDNA3.1-TAp63γ24h后，利用TUNEL细胞凋亡原位检测方法检测凋亡。7应用流式细胞仪方法检测EC9706细胞表达TAp63γ基因对细胞凋亡的影响及凋亡率。结果1通过荧光显微镜观察pcDNA3.1-GFP转染效率，可知质粒pcDNA3.1转染EC9706细胞的效率可达90％以上。2 pcDNA3.1-TAp63γ转染组和pcDNA3.1／Myc-His-TAp63γ转染组扩增得到TAp63γ(1346bp)条带，而空载体pcDNA3.1转染组和未经任何处理的EC9706则未扩增到相应条带。说明TAp63γ基因在转染前不表达，通过转染并同GAPDH比较，TAp63γ基因在mRNA水平上得到高表达。3组蛋白标签信号仅在pcDNA3.1／Myc-His-TAp63γ转染组检测到，说明通过转染并同β-actin蛋白表达水平比较，TAp63γ基因在蛋白水平得到了高表达；同时在pcDNA3.1-p53转染组检测到强的p53蛋白信号，而在其它三组只检测到极微弱的p53蛋白信号。说明p53基因在转染前存在着非常低的蛋白表达水平，转染后在蛋白水平上得到了高表达。4 EC9706转染pcDNA3.1-TAp63γ24h后，与转染pcDNA3.1 24h相比较，G0／G1期的细胞增加，同时S期的细胞减少(P＜0.05)；与转染pcDNA3.1 48h相比较，转染pcDNA3.1-TAp63γ48h后，G0／G1期的细胞明显增加，S期的细胞明显减少(P＜0.05)。5琼脂糖凝胶电泳结果显示在pcDNA3.1-TAp63γ转染组和pcDNA3.1-p53转染组出现DNA ladder，而空载体转染组则未出现DNA ladder。说明EC9706细胞转染pcDNA3.1-TAp63γ24h后可引起细胞凋亡。6 TUNEL结果显示pcDNA3.1-TAp63γ转染组凋亡的阳性细胞数比空载体转染组明显增加(P＜0.05)，说明TAp63γ表达可诱导EC9706细胞凋亡。7 Annexin V-FITC和PI合染结果显示，pcDNA3.1转染组和pcDNA3.1-TAp63γ转染组的细胞凋亡率分别为1.37％和13.64％，晚期凋亡率分别为4.49％和9.63％。三次实验的结果表明：pcDNA3.1-TAp63γ转染组的凋亡率明显高于pcDNA3.1转染组(P＜0.05)，即TAp63γ在EC9706细胞表达后，可诱导细胞凋亡。第四部分AIF和Bit1在TAp63γ诱导细胞凋亡中的作用研究第一章TAp63γ诱导细胞凋亡过程中AIF和Bit1的转位研究方法1 Western blotting测TAp63γ诱导EC9706细胞凋亡过程中caspase-3酶活性，caspase广谱抑制剂Z-VAD-fmk预处理细胞，再转染pcDNA3.1-TAp63γ，24h后流式细胞仪测凋亡率。2共聚焦显微镜和免疫荧光实验分析EC9706细胞共转染pDsRed2-Mito和pcDNA3.1-TAp63γ24h后，内生性AIF的亚细胞定位。3 EC9706细胞共转染pDsRed2-Mito和pEGFPN2-Bit1后再转染TAp63γ，共聚焦显微镜分析外源性Bit1的亚细胞定位；EC9706细胞分别转染pcDNA3.1-TAp63γ、pcDNA3.1-p53γ和pcDNA3.1 24h后，Western blotting检测线粒体、细胞质(不含线粒体蛋白)和细胞核中的AIF和Bit1蛋白。结果1在pcDNA3.1-TAp63γ转染组检测到caspase-3活性形式，抑制caspase的活性可减少TAp63γ诱导的细胞凋亡，说明TAp63γ诱导EC9706细胞凋亡过程中caspase被激活，TAp63γ诱导的细胞凋亡依赖于caspase。2结果显示空载体转染的细胞中绿光(AIF／Bit1蛋白)与红光(定位在线粒体)叠加后完全重叠，说明AIF／Bit1蛋白定位在线粒体；而TAp63γ转染的细胞中绿光呈分散状、与红光叠加后不完全重叠，说明AIF／Bit1蛋白不仅在线粒体，还在胞浆甚至在胞核。提示在TAp63γ诱导的凋亡过程中，AIF蛋白先由线粒体释放入细胞质，再由细胞质转位到细胞核；Bit1蛋白由线粒体释放入细胞质，而空载体转染的细胞未见此现象。3结果显示在pcDNA3.1-TAp63γ和pcDNA3.1-p53转染组的线粒体、胞质和胞核蛋白中均能检测到AIF，Bit1免疫信号只存在于线粒体和胞质蛋白中而胞核蛋白中没有；空载体转染组，AIF和Bit1免疫印迹信号仅在线粒体中能明显检测到。表明在TAp63γ诱导EC9706细胞凋亡的过程中，线粒体蛋白AIF和Bit1均发生了转位：AIF从线粒体释放入细胞质并转位到细胞核，Bit1从线粒体释放入细胞质。第二章靶向性发夹状小分子RNA表达载体的构建与鉴定方法1参照文献设计并化学合成siRNA的DNA模板。2利用分子生物学技术构建靶向性发夹状小分子RNA表达载体：pSilencer3.1-H1-neo-AIF-siRNA和pSilencer3.1-H1-neo-Bit1-siRNA。3 BamHⅠ+HindⅢ双酶切和测序鉴定所构建的载体。结果1重组质粒经BamHⅠ和HindⅢ双酶切后，得到4224bp和64bp两个片段，说明目的片段已连接到载体pSilencer3.1-H1-neo上。2用M13引物对重组质粒进行DNA序列测定，结果显示pSilencer3.1-H1-neo-AIF-siRNA和pSilencer3.1-H1-neo-Bit1-siRNA的序列均准确无误。第三章下调AIF或Bit1的蛋白表达水平对TAp63γ诱导细胞凋亡的影响方法1重组质粒转染EC9706细胞，G418筛选出稳定表达细胞株。2 Western blotting检测RNAi对EC9706细胞AIF和Bit1的沉默作用。3 CCK-8细胞增殖实验测AIF或Bit1蛋白下调后对细胞增殖影响。4 TUNEL实验测RNA干扰对TAp63γ诱导EC9606细胞凋亡的影响。5流式细胞仪检测RNA干扰对TAp63γ诱导EC9706细胞凋亡率的影响。结果1 RNA干扰后，AIF或Bit1蛋白水平与未干扰组相比明显下降(P＜0.05)，而阴性对照质粒转染的细胞AIF和Bit1蛋白水平与未转染细胞相比无明显差异(P＞0.05)；2 AIF-siRNA组和Bit1-siRNA组的A值在24、48和72小时与EC9706组相比均无显著性差异(P＞0.05)。说明EC9706细胞的AIF和Bit1蛋白下调以后，细胞增殖未受到影响。3 AIF-siRNA干扰后再转染pcDNA3.1-TAp63γ组和Bit1-siRNA干扰后再转染pcDNA3.1-TAp63γ组的凋亡阳性细胞数和转染pcDNA3.1-TAp63γ组相比均明显减少，差异具有统计学意义(P＜0.05)；而与空载体转染组相比均仍然增多，差异也具有统计学意义。说明下调AIF和Bit1的蛋白表达水平均可减少TAp63γ诱导的细胞凋亡，但均不能完全阻止TAp63γ诱导的细胞凋亡。4 AIF-siRNA干扰后再转染pcDNA3.1-TAp63γ组和Bit1-siRNA干扰后再转染pcDNA3.1-TAp63γ组细胞的凋亡率分别为4.52％和5.72％。EC9706细胞在转染pcDNA3.1-TAp63γ后，可促进细胞的凋亡(P＜0.05)；当使用AIF-SiRNA干扰后或使用zVAD.fmk预处理细胞后，可抑制TAp63γ诱导的细胞凋亡，且有显著性差异(P＜0.05)。提示下调AIF或Bit1的蛋白表达水平及抑制caspase的活性均可减少TAp63γ诱导的细胞凋亡，但均不能完全阻止细胞的凋亡；TAp63γ诱导的细胞凋亡依赖于AIF、Bit1和caspase。结论1 AIF基因的蛋白表达水平与食管鳞癌患者临床分期及性别无明显相关。2 Bit1的表达异常可能是食管鳞癌发生的一个早期事件，并可能与癌细胞的转移有关。3两种食管鳞癌细胞系EC9706和Eca109细胞中均存在有高表达水平的AIF蛋白和中等表达水平的Bit1蛋白。两种细胞中p63基因的表达亚型是△Np63，而不是TAp63。TAp63γ表达可抑制细胞的增殖，促进细胞的凋亡。4 TAp63γ诱导的细胞凋亡与caspase有关，抑制caspase的活性能减轻但不能完全阻止TAp63γ诱导的细胞凋亡。5成功构建靶向性抑制AIF和Bit1的siRNA表达载体。6在TAp63γ诱导的细胞凋亡过程中，AIF和Bit1从线粒体释放进入细胞质或细胞核。通过RNA干扰下调AIF或Bit1的蛋白表达水平均能抑制TAp63γ诱导的细胞凋亡，但不能完全阻止凋亡。7 TAp63γ诱导的细胞凋亡依赖于caspase、AIF和Bit1。