论文部分内容阅读
鄱阳湖泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)具有较为丰富的遗传多样性,体型和体色均有明显的差异性,为本课题组的良种选育提供了极好的材料。本研究以鄱阳湖泥鳅为材料,主要开展了两个方面的工作:一是,首次克隆获得鄱阳湖泥鳅黑色素聚集激素(melanin-concentrating hormone,MCH)和黑色素刺激激素(α-melanophore-stimulating hormone,α-MSH)及它们的受体黑色素聚集激素受体1(melanin-concentrating hormone receptor 1,Mchr1)和黑色素刺激激素受体1(α-melanophore-stimulating hormone receptor 1,Mc1r)基因,初步探究了四个基因与鄱阳湖泥鳅黑斑性状形成的关系;二是,研究了不同发育温度、水体透明度和初始投喂时间对泥鳅仔鱼成活率的影响,探讨适宜条件以提高水花苗的健康程度和成活率。获得的主要研究成果如下:1、利用RACE-PCR分别克隆出泥鳅前原黑色素聚集激素1(prepro-melanin-concentrating hormone,Pmch1)基因、阿片黑素促皮质激素原(proopiomelanocortin,Pomc)基因、黑色素聚集激素受体1(Mchr1)基因和黑色素刺激激素受体1(Mc1r)基因的cDNA全长序列,分别命名为MaPmch1、MaPomc、MaMchr1、MaMc1r。运用生物信息学软件对4个基因及其蛋白质的理化性质和结构特征进行了预测分析,并构建了系统进化树。(1)MaPmch1基因cDNA全长591bp,编码含124个氨基酸的蛋白质。泥鳅PMCH1(MaPMCH1)C末端经水解可产生17个氨基酸的环形神经肽MCH1。MaPMCH1是亲水性蛋白,二级结构以无规则卷曲为主。MCH1超二级结构具有一个反平行β-折叠片层,通过二硫键连接形成环形神经肽。同源比对发现泥鳅MCH1(MaMCH1)氨基酸序列与其它硬骨鱼类完全一致。系统进化树显示泥鳅PMCH1与鲤科鱼类PMCH1聚为一支。在哺乳动物、鸟类和鱼类中,MCH存在高度保守的序列RCM*GRVYRPCW(*代表随机氨基酸)。(2)MaPomc基因cDNA全长为1133 bp,编码含221个氨基酸的蛋白质。泥鳅POMC(MaPOMC)的107-119处水解产生13个氨基酸的α-MSH。同源分析结果说明泥鳅α-MSH(Maα-MSH)氨基酸序列与其他物种完全一致,具有HFRW结构,是一个重要的功能域。系统进化树显示MaPOMC与鲤科鱼类在同一进化方向上,且独立于鲤科鱼类之外。(3)MaMchr1基因和MaMc1r基因cDNA全长分别为1364 bp和1529 bp,编码产生包含328个氨基酸的泥鳅MCHR1(MaMCHR1)和316个氨基酸的泥鳅MC1R(MaMC1R)。预测两者的二级结构均以α-螺旋为主,三级结构均存在7个跨膜结构域,并具有DRY(天冬-精-酪)结构,是典型的G蛋白偶联受体。MaMCHR1和MaMC1R与鲤科鱼类都具有较高的同源性(90%左右),系统进化树同样表明两者在进化方向上与传统分类地位相吻合。2、利用qPCR检测不同花斑泥鳅背部皮肤、腹部皮肤和全脑组织的4个基因的表达量。结果发现MaPmch1基因在不同花斑泥鳅大脑中的表达情况无明显规律。MaPomc基因在小花斑泥鳅大脑中的表达量高于大、无花斑泥鳅,推测高表达的α-MSH能促进小花斑泥鳅在黑斑处分泌更多的黑色素,从而形成较多的黑斑。MaMchr1基因的表达主要集中在大脑,且在不同花斑泥鳅脑中表达差异不显著;MaMc1r基因的表达集中在大脑和背部皮肤,大、小花斑泥鳅脑和背部皮肤表达量相当,无花斑泥鳅大脑中的表达量高于背部皮肤。推测MaMchr1基因参与黑色素沉着较少,而MaMc1r基因背部皮肤表达高有助于黑斑形成。无花斑泥鳅MaPmch1/MaPomc值高于大、小花斑泥鳅说明,在泥鳅体内通过调节MaPmch1和MaPomc基因表达量的比例来实现泥鳅不同花斑的黑色素沉着模式。3、本文详细描述了泥鳅胚胎发育的24个时期,当水温为24℃或27℃时,胚胎发育分别历时31 h 20 min和24 h。泥鳅胚胎发育的有效积温为307.65时度,生物学零点温度为14.18℃。泥鳅孵化水温对孵化率影响不明显,但对仔鱼出膜72 h后的成活率影响较显著,24℃和27℃的成活率分别为72.42%和65.84%。在一定温度范围内,水温越高,胚胎发育时间越短,仔鱼成活率越低。当水体的透明度为5 cm时,孵出72 h后的仔鱼成活率为71.83%,显著低于15 cm和25 cm的成活率。显微观察发现水中悬浮颗粒会粘附在外鳃上,从而使其活力和呼吸受到影响。大规模繁育泥鳅时,根据仔鱼成活情况,最佳的初始投喂时间为孵出后20-30 h内(24℃),即鱼苗肠道贯通后约10 h内。结合显微技术,本研究解决了泥鳅初孵仔鱼生长过程中的关键问题,对提高泥鳅苗种的成活率和科学地指导泥鳅繁育工作具有重要意义。