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1.以绛红色小单孢菌Gbk10(△genK 作为研究对象,运用生物信息学,从小单孢菌全基因组序列中筛选出4个可能性最大的、参与庆大霉素绛红糖胺C-6’位N甲基化修饰的基因——orf2060、orf2060、orf2810、和orf5507,通过基因框内敲除的方法,分析目的基因缺失对庆大霉素生物合成代谢流的影响。具体如下:以pKC1 139作为穿梭载体,分别扩增orf2060、orf2390、orf2810和orf5507基因的上下游同源交换臂,构建4个目标序列缺失的同源重组质粒。利用接合转移的方法,分别导入到小单孢菌Gbk10中,利用平板影印法和抗性筛选,获得4株目标基因缺失的突变工程菌GbkN102(△orf2060),GbkN202(△orf2390,GbkN302(△orf2810)和 GbkN402(△orf5507)。提取出发菌株 Gbk10 及 4 株突变工程菌的次级代谢产物,经TLC和MS分析,结果表明,GbkN102、GbkN202、GbkN302和GbkN402的代谢产物,主要为庆大霉素C1a、庆大霉素C2b和庆大霉素X2,与出发菌株Gbk10相比,并无明显变化,说明基因orf2060、orf2930、orf2810和orf5507的缺失,并未阻断庆大霉素C2b的合成,对庆大霉素其他生物合成也没产生显著影响。因此,orf2060、orf2390、orf2810和orf5507并不参与庆大霉素的生物合成,也不是修饰绛红糖胺C6’-N位甲基化的关键基因。2.以黑暗链霉菌为模式菌,将庆大霉素特色基因组合到其基因组的特定位点,探索庆大霉素特色基因对黑暗链霉菌代谢产物修饰的可能性。具体如下:选择pKC1139作为穿梭载体,分别构建genB3(EcoRV)-genX替换aprD4和genW-genB3(EcoRV)替换aprD3-aprQ的同源重组质粒,通过接合转移的方法,将其依次导入黑暗链霉菌Tt49,获得庆大霉素genW-genB4-genP-genB3-genK-genB2-genX基因集替换黑暗链霉菌aprD3-aprQ-aprD4的组合工程菌TGM104。提取突变菌TGM104发酵代谢产物,经MS分析,工程菌TGM104主产氨甲酰卡那霉素B和卡那霉素B,与出发菌株Tt49相比,不再合成氨甲酰妥布霉素、妥布霉素和安普霉素组分,但也未检测到3’,4’-双脱氧氨甲酰卡那霉素B或地贝卡星等预期产物,说明庆大霉素的基因集并没有对氨甲酰卡那霉素B或卡那霉素B起修饰作用。因此,尽管成功获得庆大霉素-卡那霉素B生物合成基因组合工程菌,但庆大霉素特色基因在异源功能的表达仍有待进一步探索。