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本论通过sp.848菌发酵产酶后,经纯化得到人参皂苷糖苷酶Ⅰ型,并将其与一定浓度的原人参二醇类皂苷溶液等体积反应,计算每一种单体皂苷的动力学参数,研究各个单体皂苷在人参皂苷糖苷酶Ⅰ型的作用下的水解机制及其途径。首先,将sp.848菌活化后,选取酶活力较好菌株进行产酶发酵,所得的粗酶采用DEAE-cellulose DE-52阴离子交换树脂分离纯化,得到纯净的人参皂苷糖苷酶Ⅰ型。经SDS-PAGE检测,得出人参皂苷糖苷酶Ⅰ型的相对分子质量约为74 kDa。其次,通过将纯净的人参皂苷糖苷酶Ⅰ型溶液与一定浓度的人参皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、F2、s-Rg3溶液等体积反应,计算上述二醇类皂苷单体的动力学参数可知:水解Rh的20碳上的β-(1→6)-吡喃葡萄糖苷键的Km=14.782mM,Vmax=58.691mM/h;水解Rb2的3碳上的β-(1→2)-吡喃葡萄糖苷键的Km=19.001mM,Vmax=38.048mM/h;水解Rb3 的 3 碳上的β-(1→2)-吡喃葡萄糖苷键的Km=15.128mM,Vmax=10.822mM/h,20 碳上的β-(1→6)-吡喃木糖苷键的Km=15.127mM,Vmax=1.618mM/h;水解Rc的3碳上的β-(1→2)-吡喃葡萄糖苷键的Km=10.999mM,Vmax=6.606mM/h;水解Rd的3碳上的β-(1→2)-吡喃葡萄糖苷键的Km=364mM,Vmax=0.844mM/h;水解F2的3碳上的β-吡喃葡萄糖苷键的Km=2.335mM,Vmax=3.665mM/h;水解s-Rg3的3碳上的β-(1→2)-吡喃葡萄糖苷键的 Km=0.355mM,Vmax=0.045mM/h;在 10mM 浓度下,Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、F2、s-Rg3 的水解速度分别为 23.683、13.120、4.307(Rb3→C-Mx1 途径)、0.644(Rb3→Rd途径)、3.146、0.814、2.971、0.043mM/h。人参皂苷Rbi、Rb2、Rb3、Rc、Rd、s-Rg3结构相似,苷元相同,均含有两个糖基,只是20-0-所连的糖基不同:其中,与Rb,、Rb2、Rb3、Rc的20-0-糖链末端糖基分别为葡萄糖、吡喃阿拉伯糖、木糖和呋喃阿拉伯糖;Rd的20-0-直接与葡萄糖基相连,s-Rg3在20-O-直接与氢相连,形成羟基。与Rd结构相比,F2在3-O-缺少一个葡萄糖基。在sp.848菌产人参皂苷糖苷酶Ⅰ型水解人参二醇类皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、F2、s-Rg3的速度方面比较可知:水解总速率Rb1>Rb2>Rb3>Rc>F2>Rd>s-Rg3;水解20碳上的β-(1→6)-葡萄糖苷键速度最快,远大于水解β-(1→6)-木糖苷键的速度;水解3碳上的β-(1→2)-葡萄糖苷键的水解速度快慢为Rb2>Rb3(Rb3→C-Mx1途径)>Rc>F2>Rd>s-Rg3。分析造成3碳上的β-(1→2)-葡萄糖苷键水解速度差异的原因可能在于20碳上的糖基数目和末端糖基的不同:20碳上糖基越多水解速度越快,且吡喃阿拉伯糖基的水解速度>吡喃木糖基>呋喃阿拉伯糖基;当20碳上糖基数目相同时,3碳上糖基越少水解速度越快。经TLC及部分皂苷的HPLC检测可知,上述人参皂苷的水解机制大致可分为:在水解Rb1、Rb3(Rb3→Rd途径)时,优先水解其20碳上的糖基生成Rd,在依次水解Rd上的两个3碳上的糖基生成F2和C-K;在水解Rb2、Rb3(Rb3→C-Mx1途径)、Rc、s-Rg3时,先依次水解其3碳上的两个糖基,生成中间体皂苷,再水解20碳上的糖基生成 终 产 物 C-K;如,Rb2→C-O→C-Y→C-K,Rb3→C-Mx1→C-Mx→C-K,Rc→C-Mc1→C-Mc→C-K。在水解s-Rg3时,由于其20碳上无糖基,依次水解3碳上的两个糖基,生成终产物苷元;如,s-Rg3→s-Rh2→PPDAglycone。最后,大量培养sp.848菌发酵产酶,在45℃下转化64g人参二醇类皂苷(PPD),经AB-8脱糖,D-280脱色蒸干后,得到46.47g以F2、C-K为主的酶解产物,得率为72.61%,脱掉了 17.53g的糖类物质。以35g酶解产物为原料,在氯仿-甲醇-水洗脱体系中,其比例为8.5:1.5:0.1的条件下进行洗脱,共制得19.16g的C-K,其得率为54.74%;1.66g的较纯C-Mc,其得率为4.74%;0.64g的C-Y,其得率为1.83%;2.51g的F2,其得率为7.17%。经 HPLC 检测可知 C-K、C-Mc、C-Y、F2 的纯度依次为 92.27%、58.23%、67.85%、83.54%,与TLC检测的结果相一致。