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研究背景及目的目前非酒精性脂肪肝病（NAFLD）正在成为一种极为普遍的慢性肝病,同时在社会上也会导致巨大的医疗保健成本和经济损失,影响人们健康生活质量。作为一种临床和生物学上的异质性疾病,NAFLD包括一系列常见的肝脏疾病和广泛的组织学特征,它的发生发展涵盖单纯脂肪变性、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）、晚期纤维化、肝硬化,以及最终是肝癌。据估计,目前全球有25%的人口患有NAFLD,而且其患病率正在急剧增长,尽管NAFLD与肥胖密切相关,但NAFLD也发生在体重正常的个体中,尤其是在亚洲人群中。NAFLD发病机制涉及许多因素,包括代谢因子、环境因子和遗传因子等,近几十年来,NAFLD的发病机制研究已经取得重大突破,治疗NAFLD的靶点和药物开发也已经有所明确,但仍然有许多问题不可避免。线粒体抗病毒信号蛋白（MAVS）是先天免疫系统中维甲酸诱导基因Ⅰ（RIG-Ⅰ）蛋白信号通路的唯一接头蛋白,也是在线粒体中发现的第一个与先天免疫反应相关的分子,在传递抗病毒信号,调节干扰素基因的表达和刺激炎性因子表达的整个信号传导过程中扮演着枢纽作用。最近的两项研究表明,MAVS是免疫反应和代谢反应之间的中介。此外,也有研究结果表明,MAVS蛋白在NAFLD小鼠肝脏中的表达显著下调。然而,MAVS如何参与NAFLD的发病机制,目前仍不清楚。因此,研究MAVS在NAFLD进展中起到什么样的作用是一个值得开展的科学实验。方法为了探索MAVS在NAFLD中的作用,我们首先检测了对照组与NAFLD组中人和小鼠肝组织样品的MAVS蛋白水平,并对它们的病理切片进行HE染色和IHC染色分析脂质和MAVS表达情况,同时对肝组织中存在的多种细胞类型（原代肝细胞、枯否细胞和星状细胞等）进行分离,并用油酸（OA）、脂多糖（LPS）刺激建立细胞NAFLD模型,检测这些细胞中MAVS蛋白表达情况。为了进一步研究肝细胞MAVS在NAFLD早期的作用,我们通过构建肝细胞特异性MAVS敲除小鼠（MAVS-HKO）,检测了对照组小鼠（Flox）与MAVS-HKO组小鼠的肝重、肝重/体重、白脂重、白脂/体重,血清中ALT、AST、TG、TC等一系列生理生化指标。同时通过转录组学分析来进一步揭示MAVS-HKO小鼠中相关通路和基因的变化情况。为了确定MAVS信号在调节线粒体代谢中的直接靶点,我们采用LC-MS/MS方法分析了MAVS蛋白复合物。以转染GFP和缺失线粒体跨膜结构域的MAVS突变体作为阴性对照,与阴性对照相比,在转染MAVS的细胞中发现4个线粒体蛋白,但阴性对照中没有发现。之后对这4个蛋白进行CO-IP实验来确定是否与MAVS相互作用。同时,在OA刺激下,通过CO-IP实验对与MAVS发生相互作用的蛋白分子进行进一步检测,观察其与MAVS之间的相互作用是否有变化。此后,对互作有变化的VDAC2蛋白进行免疫荧光共定位、IP分析和GST-pulldown,结果进一步证实MAVS与VDAC2的直接相互作用。为了确定MAVS与VDAC2的相互作用区域,我们通过计算机模拟预测和CO-IP实验来进行验证。在确定MAVS与VDAC2的直接相互后,为探究MAVS对NAFLD的抑制作用是否由VDAC2介导。为此,我们检测了小鼠原代肝细胞Mock、Ad-MAVS、Si-VDAC2、Ad-MAVS+Si-VDAC2组的MAVS和VDAC2的m RNA水平,并用OA刺激以上四个小组的小鼠原代肝细胞后,进行油红O染色检测脂滴的情况以及检测TG、TC、NEFA等指标和脂肪相关通路基因Cd36、Fatp1、Pparγ、Elovl2和Plpp3的m RNA水平。结果与未发生脂肪变性的对照组肝脏相比,NAFLD患者组的肝组织中MAVS蛋白水平明显降低;与正常饮食（NC）组的肝脏相比,高脂肪饮食（HFD）诱导的NAFLD小鼠的肝脏始终显示出MAVS蛋白的显著下调;同时人和小鼠肝脏切片的HE染色和IHC染色结果证实MAVS蛋白表达下调;同时与对照组原代肝细胞相比,OA处理的原代肝细胞中MAVS蛋白水平下调,相比之下,枯否细胞和星状细胞中的MAVS水平不受LPS处理的影响。这些结果也在人Huh-7肝细胞和LX2星状细胞系中得到了证实。以上结果表明,NAFLD和MAVS在肝细胞中存在特异性很强的相关性。与Flox对照小鼠相比,MAVS-HKO组小鼠经HFD喂养12周后,肝重、肝重/体重增加,而白脂重、白脂/体重没有显著变化。此外,肝细胞中MAVS在特异性敲除后,肝脂肪变性及肝损伤有显著的加重,表现为肝脂质含量增加,组织学脂质积累增加,血清ALT和AST含量升高。转录组学分析进一步揭示了MAVS-HKO小鼠的促脂肪生成通路和基因的广泛上调。以上结果表明肝细胞MAVS在保护脂肪肝病理方面的具体作用和主要作用。与阴性对照组相比,通过蛋白质谱检测发现了4个线粒体蛋白,其中VDAC2、PACS2和ATPIF1通过CO-IP实验被证实与MAVS相互作用。同时在OA刺激下,MAVS与VDAC2之间的相互作用被特异性下调,而MAVS与PACS2或ATPIF1之间的相互作用没有变化,说明VDAC2与MAVS存在直接相互作用。最后通过免疫荧光共定位、IP分析和GST-pulldown进一步证实MAVS与VDAC2的直接相互作用。计算机模拟预测和CO-IP实验验证显示,MAVS与VDAC2的n端延伸结构域相互作用。在OA刺激下,VDAC2缺失显著加重肝细胞的脂质积累。在敲除VDAC2后,MAVS防止肝细胞中脂质过度积累的保护作用基本被消除。此外,当敲除VDAC2后,过表达MAVS导致的脂肪生成基因的下调情况消失了。这些结果表明,VDAC2是MAVS在保护肝脂肪变性中所必需的。结论MAVS在NAFLD中显著下调,MAVS蛋白可以阻断肝细胞中的脂质积累,同时肝细胞特异性敲除MAVS后可加剧肝脂肪变性。VDAC2是MAVS的下游靶标,并且VDAC2是MAVS对肝脂肪变性产生影响所必需的。创新点1.确定敲除MAVS加重NAFLD发生发展过程中的肝细胞脂肪变性;2.发现MAVS对NAFLD进展的影响依赖于VDAV2;3.提出MAVS-VDAC2轴可以作为抑制NAFLD进展的理想靶标。