【研究背景】当前救治大面积深度烧伤病人的主要困难在于自体的皮源严重不足,使得早期无法有效的封闭创面,而异体皮加微粒皮移植只能暂时覆盖创面而不能长期成活,以致病人发生感染、脓毒症,最后全身多器官出现衰竭而死亡。这些问题严重地制约了我们对大面积烧伤病人临床治疗水平的发展和提高。因此,诱导永久的免疫耐受,使得移植的异体皮甚至异种皮可以长期存活,就成为烧伤界当前一个重要的临床问题[1]。近来的一些研究发现,造血干细胞移植后形成混合嵌合体可诱导供体产生特异性免疫耐受,并分别在动物实验及临床应用中得到了证实[2-4]。在诱导混合嵌合体的过程中,无论是通过清髓性还是非清髓性方案,受体的预处理都离不开细胞毒性药物或是全身照射,以提高造血干细胞移植的成活率,这就在很大程度上限制了该技术的临床推广和应用[5, 6]。烧伤后的病人本身免疫力下降,尤其是T细胞免疫的抑制,使T细胞对异体抗原呈低反应性,不适合使用强烈的损伤性预处理,因此,必须找寻一种温和的预处理方式。间充质干细胞同时具有免疫调节和支持造血重建的功能,大量临床及动物实验均表明它可以移植免疫排斥反应的发生,及治疗激素无效的移植物抗宿主病。本实验拟通过骨髓腔内骨髓移植联合间充质干细胞共移植的方法诱导供体特异性免疫耐受,并延长异体皮肤的存活时间。【研究目的】探讨在不进行清髓或非清髓预处理的情况下,利用骨髓腔内骨髓移植联合间充质干细胞共输注,形成稳定的混合嵌合体,诱导同种异体皮肤移植物免疫耐受的可行性。【研究内容】1.体外分离小鼠不同组织来源的间充质干细胞,扩增培养,观察其形态,细胞增殖情况及多向诱导分化的能力。2.取小鼠不同组织来源的间充质干细胞(丝裂霉素C处理)与同种异基因淋巴细胞(植物血凝素刺激)共培养,通过MTT比色法检测淋巴细胞的增殖情况,Western-Blot检测foxp3蛋白含量的变化,实时定量RT-PCR检测foxp3 mRNA的变化,从而探讨其可能的作用机制。3.在小鼠及兔动物模型中采用骨髓腔内骨髓移植联合间充质干细胞共输注诱导稳定混合嵌合体的生成,并行异体皮移植验证免疫耐受的形成,观察皮片存活时间,检测体内嵌合体的情况,混合淋巴细胞反应,Western-Blot检测foxp3蛋白含量的变化,实时定量RT-PCR检测foxp3 mRNA的变化。【研究结果】1.不同组织来源的间充质干细胞均可分离培养,体外扩增,形态呈梭形,细胞生长曲线呈S形,细胞经成脂诱导,油红O染色后可见红色脂滴,经成骨诱导,碱性磷酸酶染色后见碱性磷酸酶表达阳性。2.不同组织来源的间充质干细胞体外均可抑制异基因淋巴细胞的增殖,且foxp3的蛋白及mRNA的表达均明显上升。3.实验组小鼠移植皮片存活时间明显延长,其中,存活时间最长的已超过100天。但在兔的移植模型中,实验组皮片存活时间与对照组无明显差别。【研究结论】1.间充质干细胞易于体外分离培养,可以稳定传代扩增至足够数量用于骨髓移植前的预处理。2.间充质干细胞体外明显对淋巴细胞增殖有抑制作用,而且这种作用可能是通过上调淋巴细胞foxp3的表达来实现的。3.间充质干细胞输入小鼠体内后有利于骨髓移植后造血干细胞的植入,形成稳定的混合嵌合体,产生免疫耐受,使移植物长期存活。但在兔的动物模型中,未观察到移植物存活时间延长,考虑可能是因为两次取髓时间间隔较短,造血干细胞数量尚未恢复。