论文部分内容阅读
1目的本研究分别从临床与动物实验两个方面观察类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)血小板微粒(platelet microparticles,PMPs)、细胞因子及相关实验指标的变化,评价新风胶囊(Xinfeng Capsule,XFC)对其的影响,探讨XFC干预PMPs表达的作用机制。2方法2.1实验研究将72只清洁级雄性SD大鼠随机分为正常对照(Normal control,NC)组、模型对照(Model control,MC)组、新风胶囊高剂量(Xinfeng Capsule High Dose,XFCH)组、新风胶囊中剂量(Xinfeng Capsule Medium Dose,XFCM)组、新风胶囊低剂量(Xinfeng Capsule Low Dose,XFCL)组、甲氨蝶呤(Methotrexate,MTX)组,每组12只。MC、XFCL、XFCM、XFCH、MTX组大鼠右后足跖皮内均注射弗氏完全佐剂0.1ml致炎,复制佐剂关节炎(adjuvant arthritis,AA)大鼠的模型。致炎后第19天开始灌胃给药,剂量按照各种实验动物间单位体表面积的用药量相等的原则进行药物换算,连续给药30天。观察各组大鼠足趾关节肿胀度、关节炎指数(Arthritis index,AI),酶联免疫吸附测定法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测各组大鼠血清中白介素(interleukin,IL)-1、IL-4、IL-6、IL-10、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)的水平,流式细胞分析技术检测PMP标志物CD61、CD41双阳性的表达情况,超微电镜观察血小板超微结构的变化,光镜观察各组大鼠足趾关节滑膜组织的变化,蛋白免疫印迹技术(Western Blotting,WB)检测各组大鼠腹主动脉中PI3K及AKT的表达变化及XFC对以上指标的影响。2.2临床研究所选60例RA患者均来自2014年7月至2015年7月安徽省中医院风湿免疫科的住院病人,且符合1987年ACR修订的RA分类标准和2009年ACR/EULAR提出的RA分类标准和评分系统,中医诊断标准符合卫生部颁布的《中药新药治疗痹病的临床指导原则》。将60例RA患者随机分组为XFC组、MTX组、MTX+XFC组各20例。另设20例正常对照者。采用生化分析仪检测基础生化指标及血常规,ELISA检测血清IL-1、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、VEGF的含量,流式细胞术检测PMPs标志物CD61、CD41双阳性的表达情况,问卷量表的方法来观察RA患者的生活质量变化及焦虑抑郁情绪的改变,观察XFC对RA患者的疗效、PMPs及细胞因子水平等相关实验室指标的影响。3结果3.1实验研究结果3.1.1 AA大鼠体质量、足趾肿胀度和AI变化及XFC对其影响造模前各组大鼠体质量、足跖肿胀度及AI比较无统计学意义。致炎后第19日给药,与NC组比较,MC、XFCL、XFCM、XFCH、MTX组大鼠足趾肿胀度和AI均显著升高(P<0.01),MC组与各治疗组之间比较无差异(P>0.05)。连续给药30天后,与NC组比较,MC组与各治疗组大鼠足趾肿胀度和AI仍升高,体重降低,(P<0.01或P<0.05);与MC组比较,各治疗组大鼠足跖肿胀度和AI明显降低,体重增加,(P<0.05或P<0.01);与MTX组相比,XFCM组体量有所增加,足趾肿胀度与AI降低,但差异无统计学意义。3.1.2 AA大鼠关节病理形态学变化及XFC对其影响光镜下观察各组AA大鼠的足趾关节HE染色病理切片:NC组大鼠的滑膜组织结构清晰,未见增生、突起,无炎细胞浸润,细胞排列规则,分层较少,关节软骨及骨结构完整;MC组大鼠关节滑膜中可见大量的炎性细胞浸润,明显的滑膜组织增生及滑膜血管翳形成,滑膜衬细胞分层增多,关节面模糊,部分关节软骨表面毛糙或缺如;XFCM组大鼠关节滑膜、血管壁可见少量炎细胞浸润,滑膜组织结构较MC明显改善,增生程度减轻,关节面较规整;与XFCM组比较,MTX组大鼠关节滑膜衬细胞增厚,部分关节软骨可见血管翳形成,关节面欠规整;XFCL和XFCH组大鼠关节可见炎性细胞浸润于滑膜及其周围组织,滑膜血管翳增生,滑膜衬细胞增厚,关节面较模糊,有关节软骨及骨破坏。3.1.3 AA大鼠血清PMPs阳性表达率的变化及XFC对其影响与NC组比较,MC、MTX、XFCL、XFCH组PMPs均明显升高,差异具有统计学意义(P<0.01),XFCM组PMPs略有升高,但差异无统计学意义;与MC组比较,MTX、XFCL、XFCM、XFCH组PMPs均显著下降(P<0.01);与MTX组比较,XFCM组PMPs降低(P<0.05),而XFCL、XFCH组无统计学差异。3.1.4 AA大鼠血清细胞因子IL-6、IL-10、VEGF水平的变化及XFC对其影响与NC组比较,MC、XFCL、XFCH、MTX组IL-6、VEGF均明显升高、IL-10明显降低(P<0.01),XFCM组IL-6升高、IL-10降低(P<0.01),VEGF有所升高,但差异无统计学意义;与MC组相比,XFCL、XFCM、XFCH、MTX组IL-6、VEGF明显降低、IL-10显著升高(P<0.05或P<0.01);与MTX组比较,XFCM组VEGF明显降低(P<0.05)。3.1.5 AA大鼠腹主动脉组织PI3K、AKT的表达变化及XFC的影响在大鼠腹主动脉组织中,与NC组比较,MC、MTX、XFCL、XFCM、XFCH组PI3K、AKT均明显上升(P<0.01);与MC组比较,MTX、XFCL、XFCM、XFCH组PI3K、AKT均明显降低(P<0.01);与MTX组比较,XFCL、XFCM、XFCH组PI3K明显上升(P<0.01),AKT升高(P<0.01或P<0.05)。3.1.6 AA大鼠PLT超微结构变化及XFC对其影响电镜下可见:NC组血小板呈椭圆形、表面光滑,伪足少见,胞质内可见散在的α颗粒、线粒体及囊泡状开放的管道系统;MC组血小板伸出伪足,部分脱落形成囊泡状PMPs,胞质结构明显损伤,胞质内α颗粒、线粒体减少;MTX组血小板伪足突起较MC组减少,α颗粒、线粒体较MC组增多,部分胖胀、空泡样变;XFCL组血小板有较多伪足突起,α颗粒、线粒体较MC组增多,较MTX组减少,部分肿胀、空泡样变;XFCM组血小板无伪足,基本保存椭圆形结构,α颗粒、线粒体明显较MTX组增多,少数空泡化;XFCH组血小板有少许伪足突起,α颗粒、线粒体明显增多。3.2临床研究结果3.2.1 RA患者PMPs、细胞因子的变化及相关性研究共检测20例NC组及60例RA组的PMPs阳性表达率、IL-1、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、VEGF水平,与NC组比较,RA组的PMPs、IL-1、IL-6、TNF-α、VEGF水平均有明显升高,IL-4和IL-10明显降低,差异均有统计学意义;相关性分析显示,PMPs与IL-1、IL-6、TNF-α、VEGF呈正相关,与IL4、IL-10呈负相关。3.2.2 RA患者PMPs、细胞因子与相关实验室指标的相关性研究相关性分析显示,PMPs与ESR、CRP、PLT均呈正相关,IL-1、TNF-α与ESR呈正相关,IL-6、VEGF与CRP呈正相关;关节疼痛、关节肿胀、关节压痛与PMPs、IL-1、IL-6、TNF-α均呈正相关与IL-4呈负相关(P<0.05或P<0.01);关节肿胀与IL-10呈负相关,晨僵与PMPs、IL-1、IL-6、呈正相关;生活质量总积分与PMPs、IL-1、TNF-α呈正相关(P<0.05);DAS28与PMPs、IL-1、IL-6、TNF-α呈正相关,与IL-10呈负相关。3.2.3三组病例临床疗效比较ACR20/50/70卡方检验P值>0.05,说明三组间的差异不具有统计学意义;但由表中的数值可以看出,MTX+XFC组的疗效要略优于MTX组和XFC组。3.2.4三组RA病例治疗前后PMPs与细胞因子的变化情况与治疗前相比,三组药物治疗后PMPs、IL-1、IL-6、TNF-α、VEGF均明显降低(P<0.05或(P<0.01),IL-4、IL-10显著升高(P<0.05或P<0.01);治疗后,与MTX组相比,MTX+XFC组PMPs、IL-6、TNF-α降低(P<0.01);IL-4、IL-10升高(P<0.05或(P<0.01),XFC组IL-1、VEGF有所升高(P<0.05或P<0.01)。3.2.5三组RA病例治疗前后相关实验室指标变化情况与治疗前比较,三组药物治疗后ESR、CRP、PLT均明显降低(P<0.05或P<0.01),中医症候体征积分各项及总积分、生活质量积分各项、HAQ、DAS28、SAS、SDS均有明显降低(P<0.05或P<0.01);治疗后,与MTX组比较,MTX+XFC组CRP降低更明显(P<0.05),治疗后关节疼痛、肿胀、少气懒言、食欲减退明显改善(P<0.05),AQT、社会功能、心理功能、健康自我认识能力均有所改善(P<0.05或P<0.01),HAQ、DAS28、SDS明显降低(P<0.05),XFC组少气懒言、食欲减退降低(P<0.05)。4结论4.1 AA大鼠会出现体质量下降以及类似RA的关节炎症的表现和病理结构,而XFC能改善大鼠的关节炎症表现及滑膜的病理结构,降低滑膜炎症,抑制血管翳增生,且对大鼠生长无不良影响。4.2 AA大鼠体内确实存在PMPs的释放和PLT活化,而XFC能抑制AA大鼠体内PMPs的释放和PLT活化,且中剂量的XFC作用优于MTX。4.3 AA大鼠体内存在促炎因子和血管活性因子的升高以及抑炎因子的降低,而XFC可以通过平衡细胞因子网络发挥抑制炎症发应和滑膜血管新生的作用,且中剂量XFC的效果更加明显。4.4 AA大鼠体内存在PI3K/Akt信号通路的上调,而XFC可以有效的调节AA大鼠腹主动脉组织中PI3K/Akt信号通路水平,且作用优于MTX。4.5 PMPs可通过促进关节滑膜炎症反应以及滑膜血管翳的形成,从而在RA的发生发展中发挥重要作用。4.6 XFC可通过下调PI3K/Akt通路,降低PMPs阳性表达率,维持细胞因子网络的平衡,从而改善RA滑膜炎症和血管翳增生,达到治疗RA的目的。4.7 RA患者体内存在PMPs的释放,其中促炎因子和血管活性因子的升高以及抑炎因子的降低与PMPs的释放有关。4.8 PMPs与RA患者的疾病活动度及关节症状呈正比。4.9 XFC能显著抑制RA患者体内PMPs的释放。4.10 XFC能够显著提高RA患者外周血中抑炎因子,降低促炎因子和血管活性因子的表达。4.11 XFC能明显缓解RA患者的疾病活动度,改善局部和全身症状、生活质量以及精神状态;且在改善少气懒言、食欲减退方面优于MTX。