目的蛇毒是一种成分复杂的天然生物毒素,含有多种酶类和药理活性多肽,就眼镜蛇(Naja naja atra)蛇毒而言,含有细胞毒素(cytotoxin,CTX)、神经毒素(neurotoxin,NT)和多种酶类等,其中CTX在体外对多种瘤细胞具有直接溶解作用。从蛇毒中分离细胞毒素资源有限,成本高,技术难,质量标准难统一。本文拟应用基因克隆的方法,构建舟山眼镜蛇毒细胞毒素(cytotoxin,CTX)原核表达载体(pET42α(+)- CTX),并在大肠杆菌中表达CTX重组蛋白。旨在为开发眼镜蛇毒细胞毒素作为抗肿瘤药物提供药学和药理学资料;也为深入研究细胞毒素结构与功能关系创造条件。方法从舟山眼镜蛇毒中分离纯化细胞毒素(CTX),测定N-末端及C-末端的氨基酸序列并据此设计引物,含KpnⅠ酶切位点、SacⅠ酶切位点。P1:5’-GGGGTACCAAAACTCTGCTGCTGACCTTG-3’, P2:5’-CGAGCTCTCAGTTGCATCTGTCTGTATTG-3’,以提取的舟山眼镜蛇毒腺总RNA为模板,RT-PCR方法合成扩增其中的细胞毒素基因序列(CTX cDNA)。将CTX cDNA定向克隆到原核表达载体pET42α(+)中,获得重组DNA(pET42α(+)- CTX),经KpnⅠ/ SacⅠ酶切鉴定后,热激转化至大肠杆菌DH5α。获得单克隆(CTX-pET42α(+)-DH5α)增殖后,抽提质粒,并用KpnⅠand SacⅠ双酶切图谱分析、T7引物PCR和DNA序列测定,鉴定阳性转化子DNA序列,该序列与文献报导的蛇毒CTX基因序列一致;将鉴定确认的阳性转化子重组质粒(pET42α(+)-CTX),应用CaCl2法转化至大肠杆菌表达菌E.coli BL21(DE3)中,测序鉴定。IPTG诱导CTX融合蛋白表达,SDS-PAGE凝胶电泳鉴定表达产物;GSTrap FF亲和层析纯化融合蛋白CTX,Western-blotting方法鉴定表达产物的抗原性。结果1. RT-PCR扩增得到的CTX cDNA243bp左右,与预期的CTX基因大小基本一致。2.构建原核表达质粒pET42α(+)- CTX,经双酶切、T7引物PCR和DNA序列测定,证实CTX基因已正确插入质粒载体的多克隆位点。得知CTX的cDNA大小约为243bp。3.在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中成功表达融合蛋白CTX,SDS-PAGE凝胶电泳显示CTX以可溶性蛋白及包涵体形式存在,融合蛋白分子量为:37.9kD。4.纯化得到融合CTX,具有眼镜蛇毒细胞毒素的抗原性。结论成功构建CTX基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中表达,获得CTX融合蛋白具有眼镜蛇毒细胞毒素的抗原性。