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大叶秦艽(Gentiana macrophylla Pall.)为龙胆科(Gentianaceae)龙胆属(Gentiana)秦艽组(Gentiana macrophylla)植物,以根入药,在《神农本草经》中列为中品,具有祛风除湿、清虚热、退湿热的功效。在之前研究基础上,为进一步揭示大叶秦艽药材中化学成分,发现大叶秦艽药材新的药理作用,探讨其作用机制及发挥作用的关键药效物质,本论文以陕西秦岭地区栽培大叶秦艽为研究对象,从以下方面展开研究:(一)大叶秦艽药材的化学成分研究通过柱层析色谱法、制备液相色谱法和结晶法从大叶秦艽药材醇提取物中共分离出33个化合物,以波谱分析(MS和NMR)和对照品对照分析对这33个化合物结构进行鉴定,其中12个化合物为首次从大叶秦艽中分离鉴定,分别为:6′-O-乙酰龙胆苦苷、2’-(2,3-二羟基苯甲酰)-龙胆苦苷、6’-O-β-D-葡萄糖基马钱苷酸、乌苏醇、山楂酸、1α,2α,3β,24-四羟基-12-烯-28-乌苏酸、硬脂酸、二十一烷酸、棕榈酸、棕榈酸乙酯、5-formylisochromen-1-one和原儿茶醛,上述12个成分中5-formylisochromen-1-one、二十一烷酸和棕榈酸乙酯为首次从龙胆属植物中分离鉴定。另有21个化合物结构分别鉴定为:Gentimacroside、龙胆苦苷、獐芽菜苦苷、獐芽菜苷、马钱苷酸、6′-O-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷、6’-O-β-D-葡萄糖基獐牙菜苷、栎樱酸、熊果酸、齐墩果酸、β-谷甾醇、豆甾醇、胡萝卜苷、异荭草苷、异牡荆黄素、邻苯二甲酸二丁酯、秦艽酰胺、红白金花内酯、红白金花酸、蔗糖和龙胆三糖。(二)大叶秦艽药材的质量评价及指纹图谱的建立采用HPLC-ELSD方法,经方法学验证,建立一种以龙胆苦苷、獐芽菜苦苷、马钱苷酸和6’-O-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷为特征性成分评价大叶秦艽药材质量的方法,并采用该方法对该地区不同产地大叶秦艽药材中这4种成分的含量进行测定。结果发现陕西秦岭地区栽培大叶秦艽药材中这4种活性成分含量较高,表明该地区栽培大叶秦艽药材质量较优,具有很好的临床应用价值及进一步开发的潜在价值。在上述基础上,进一步采用HPLC-ELSD方法,经色谱条件优化,测定并采集10批大叶秦艽药材的色谱图谱,经国家药典委员会中药指纹图谱软件分析,建立大叶秦艽药材HPLC-ELSD指纹图谱。采用对照品对照分析,对特征图谱中8个共有特征色谱峰对应的化学成分确认为:马钱苷酸、6’-O-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷、獐芽菜苦苷、龙胆苦苷、齐墩果酸、胡萝卜苷、栎樱酸和β-谷甾醇。通过指纹图谱的建立及特征峰对应化学成分的确认,为该地区栽培大叶秦艽药材内在质量控制提供依据。(三)大叶秦艽药材提取物对NAFLD的作用研究采用果糖诱导的NAFLD小鼠动物模型研究大叶秦艽醇提取物对NAFLD的作用。实验结果发现经大叶秦艽药材醇提取物给药后,模型小鼠体重及血清甘油三酯、胆固醇、游离型脂肪酸、胰岛素和葡萄糖水平降低。进一研究发现大叶秦艽药材醇提取物能减轻NAFLD小鼠肝脏脂肪蓄积,调节脂肪代谢,抑制肝脏炎症(TNF-α、IL-6、XBP1、P-IKK alpha/beta、P-JNK1/2/3)的发展,缓解肝脏胰岛素抵抗(P-IRS1),提高肝脏抗氧化应激水平(GSH、NO、SOD、GSH-px和CAT),而这种作用的发挥可能与它对肝脏抗氧化酶活性的调控以及对肝脏JNK和IKK信号通路和XBP1蛋白表达的调控作用有关。以上结果表明:秦艽醇提取物对果糖引起的小鼠NAFLD及其并发症,具有明显改善作用。(四)基于谱效关系分析研究大叶秦艽药材提取物抗NAFLD的药效物质基础采用果糖诱导的NAFLD小鼠动物模型,进一步研究陕西秦岭不同产地10批大叶秦艽药材醇提取物对小鼠NAFLD的改善作用,并选取小鼠肝脏中甘油三酯和血清中甘油三酯的水平为药效指标,以灰度关联分析方法,分别计算出小鼠血清中甘油三酯和肝脏中甘油三酯的降低率与大叶秦艽药材HPLC-ELSD指纹图谱中8个特征峰相对峰面积的关联度。结果表明,10批大叶秦艽药材提取物给药均能不同程度降低小鼠肝脏脂肪蓄积,以关联度大小为评价指标,表明龙胆苦苷所对应的色谱峰与小鼠肝脏中甘油三酯降低率的关联度和小鼠血清中甘油三酯降低率的关联度最大,该结果说明龙胆苦苷可能为秦艽药材醇提取物减轻小鼠肝脏脂肪蓄积作用的关键药效成分。(五)龙胆苦苷对NAFLD的改善作用研究采用果糖诱导的小鼠NAFLD动物模型,研究发现龙胆苦苷给药显著缓解果糖引起的小鼠体重增加,抑制血清甘油三酯、胆固醇、尿酸、胰岛素和葡萄糖水平的升高。进一步研究发现龙胆苦苷明显减轻果糖引起的小鼠肝脏气球样变性和脂肪蓄积,其作用机制可能与减少尿酸生成(XO)、提高肝脏的抗氧化应激水平(MDA、SOD、GSH-px、CAT和Nrf2)、调节肝脏脂肪代谢(FAS、SREBP-1和ACC1)和抑制肝脏炎症(TNF-α和IL-6)发展有关。以上结果表明:龙胆苦苷对果糖引起的小鼠NAFLD及其并发症,具有明显改善作用。总结:本研究揭示了大叶秦艽药材中部分化学成分;通过质量评价分析发现陕西秦岭地区所栽培大叶秦艽药材具有临床应用价值,并运用HPLC-ELSD建立其内在质量控制方法;研究发现大叶秦艽药材醇提取物对小鼠NAFLD具有改善作用,以谱效关系分析发现龙胆苦苷可能是其发挥抗NAFLD作用的关键药效物质,通过实验进一步研究表明龙胆苦苷对小鼠NAFLD具有很好的改善作用。龙胆苦苷在陕西秦岭地区栽培大叶秦艽药材中含量很高,且按照新药安全、有效和质量可控的基本要求,龙胆苦苷具有很好的成药性,有望开发为治疗NAFLD的新药。