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中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV)是2012年首次在沙特阿拉伯出现的一种新型冠状病毒。目前感染人的冠状病毒一共有6种，最早是上世纪60年代发现的人冠状病毒229E(human coronavirus-229E,HCoV-229E)和OC43(human coronavirus-OC43,HCoV-OC43),接着2004年在荷兰分离出人冠状病毒NL63(human coronavirus-NL63，HCoV-NL63)，2005年在香港鉴定出人冠状病毒HKU1(human coronavirus-HKU1，HCoV-HKU1)。这些冠状病毒感染人后只会产生一些很轻微的感冒症状，然而在2002年底于中国广东爆发的严重急性呼吸综合征冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS-CoV)以及2012年爆发于中东的MERS-CoV却有着很高的致死率，给人类健康造成严重威胁。 MERS-CoV基因组的组成和其它冠状病毒一样，编码刺突蛋白(spike protein，S)的基因位于3末端。S蛋白属于Ⅰ型病毒融合蛋白，以三聚体形式跨膜存在于病毒囊膜的表面，形成病毒粒子的刺突结构。全长包含1353个氨基酸，并且被高度糖基化，预测有21个N-连接的糖基化位点。从结构上，S蛋白可以被分为两部分:位于N-端形成球状头部的S1亚单位结构域，和位于C-端形成茎干区的S2亚单位结构域。位于S1亚单位C-端的受体结合域(receptor binding domain，RBD)大约由240个氨基酸残基组成，主要负责识别与结合宿主细胞的表面受体二肽基肽酶-4（dipeptidyl peptidase-4，DPP4）。因此，阻止RBD与DPP4的结合就可以相应地抑制病毒的吸附和进入。当RBD与DPP4结合后，由S2亚单位结构域介导的宿主细胞膜和病毒囊膜的融合紧接着发生。S2主要由融合肽（fusion peptide，FP）以及两个保守的七肽重复区(heptad repeat1and2，HR1和HR2)、跨膜区(transmembrane region,TM)、胞质尾(cytoplasmic tail，CP)组成。膜融合发生时，FP会延伸插入到宿主细胞膜上，HR1和HR2变构形成六螺旋束融合核心，其中3股HR1聚集形成三聚体的内疏水核心，3股HR2围绕着疏水核心结合在HR1的外侧沟中。整个膜融合过程可以分为三步:膜融合前，中间状态，膜融合后。一般来说，六螺旋束疏水核心的形成标志着已经进入融合后状态。在膜融合的中间状态，HR1和HR2都会短暂暴露在外。因此，针对这两个七肽重复区的抑制剂可以抑制其相互作用，使膜融合过程停留在中间状态，阻止融合核心的形成，进而成功阻止病毒进入宿主细胞。 基于以上原理，本研究设计出MERS-CoV五螺旋束蛋白(five-helix bundle，MERS-5HB)。MERS-5HB是由六螺旋束中的五股螺旋组成，包括其中的三股HR1和两股HR2。HR1和HR2分别由两个linker连接:HR1-SGGRGG-HR2-GGSGGSGG-HR1-SGGRGG-HR2-GGSGGSGG-HR1。克隆上述片段到原核表达载体，构建重组质粒pET-28a-MERS-5HB进行蛋白表达，纯化的MERS-5HB经分子排阻层析鉴定以单体形式存在。通过圆二色谱分析其二级结构，证明MERS-5HB属于典型的α螺旋。在温度梯度变性实验中，MERS-5HB显示出很高的热稳定性。与六螺旋束相比，MERS-5HB缺少一股HR2，因此可以提供结合外源HR2的空间位置。酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)实验验证MERS-5HB与来自MERS-CoV HR2的合成多肽MERS-HR2P具有很强的相互作用，EC50≈5.4nmol/L，结果符合原始设计。通过生物膜层表面干涉技术(biolayer interferometry,BLI)进一步证实MERS-5HB和HR2P高亲和力的结合，其解离平衡常数(KD)为0.24nmol/L。这种特异性的强结合力为MERS-5HB抑制病毒进入提供了一定的结构基础，紧接着我们在细胞层面上对此作了评价。 利用HIV骨架质粒pNL4-3.Luc.R-E-和克隆有MERS-CoV刺突蛋白S全长基因的质粒pcDNA3.1-S共转染293T细胞制备MERS-CoV假病毒，用于评价MERS-5HB抑制假病毒进入Huh-7细胞的能力。实验数据表明，MERS-5HB在15μmol/L浓度时，可以达到90％的抑制活性;在1μmol/L浓度时，达到50％的抑制活性。当MERS-CoV病毒的RBD与Huh-7细胞表面受体DPP4结合后，引起S2一系列的构象变化。在这个构象变化的过程中，外源抑制剂MERS-5HB会与暴露出的HR2高亲和力结合，从而破坏融合核心六螺旋束的形成，即阻止病毒囊膜与宿主细胞膜的融合，最终抑制病毒进入靶细胞。 分别转染表达增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)的质粒pEGFP-C3到Huh-7细胞（Huh-7/EGFP），和质粒pcDNA3.1-S到293T细胞(293T/MERS-S)。在转染后6小时，将这两种细胞用胰酶消化，然后按照一定比例混合共培养，48小时观察合胞体的形成情况。发现随着293T/MERS-S细胞数量的减少，合胞体的形成数目也相应减少，说明膜融合的发生是由S蛋白介导完成。加入抑制剂MERS-5HB后，合胞体形成随着蛋白浓度的减少而逐渐增加，证明MERS-5HB对S蛋白介导的膜融合具有明显的抑制活性。 最后，我们利用MERS-5HB作为抗原筛选噬菌体展示文库，并得到一些候选抗体。然而这些候选抗体克隆与MERS-5HB的结合能力较弱，所以没有发现明显的病毒中和效果，期望能够改进筛选策略找到中和能力更强的抗体。 总的来说，MERS-5HB作为融合抑制剂，通过抑制膜融合过程中六螺旋束的形成有效地抑制病毒进入宿主细胞，有助于人们进一步理解膜融合发生的过程，同时MERS-5HB的设计思路也为其它针对Ⅰ型囊膜病毒抑制剂的开发提供重要参考。