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第一部分多重实时荧光定量PCR方法在呼吸道合胞病毒和腺病毒检测中的意义:Meta分析目的:通过Meta分析评价多重实时荧光定量PCR(multiplex real time PCR,mRT-qPCR)方法在常见呼吸道病毒呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)和腺病毒(adenovirus,ADV)感染的诊断价值,为临床应用提供参考。方法:检索数据库包括PubMed、EMBASE、Cochrane、万方、CNKI等,检索2010年1月至2018年1月关于mRT-qPCR方法检测呼吸道病毒感染的中英文文献,由2位研究者独立筛选文献和提取资料,并采用QUADAS-2工具评价纳入研究的偏倚风险后,采用Meta-disc 1.4对数据进行统计分析,Deek检验检测发表偏倚的存在。结果:本研究纳入10篇文献共2528例样本。Meta分析结果显示,mRT-qPCR检测RSV的合并灵敏度(sensitivity,Sen)=0.87(95%CI:0.83-0.90)、合并特异性(specificity,Spe)=0.98(95%CI:0.97-0.98)和受试者工作特征曲线下面积(area under curve,AUC)=1.00。mRT-qPCR检测ADV的合并Sen=0.64(95%CI:0.56-0.71)、合并Spe=0.99(95%CI:0.98-0.99)和AUC=0.99。Deek漏斗图提示存在发表偏倚的可能性较小。结论:mRT-qPCR方法检测RSV和ADV的灵敏度有待提高,但检测综合能力较好,对临床早期诊断呼吸道病毒感染具有一定的应用价值。第二部分一步法巢式实时荧光定量RT-PCR检测呼吸道合胞病毒方法的建立及应用目的:呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)在全世界范围内引起严重的呼吸道感染。体弱、老年人和严重免疫受损的病人感染RSV后病毒载量较低,很难检测,因此,能够高灵敏和准确的检测RSV感染十分必要。方法:本研究利用锁核酸(locked nucleic acid,LNA)修饰外引物建立了一步法巢式实时荧光定量RT-PCR(one tube nested real time RT-PCR,OTNRT-PCR)检测呼吸道合胞病毒的方法,其具有灵敏度高、操作简便和避免交叉污染的优点。利用RSV毒株进行灵敏度评价,采用常见呼吸道病毒进行特异性评价,616例临床标本用于临床检测效能评价,并与传统的基于TaqMan探针的实时荧光定量PCR(real time PCR,RT-qPCR)方法和传统的两步巢式PCR(two-step nested PCR,N-PCR)方法进行平行比较。结果:OTNRT-PCR方法检测RSV的分析灵敏度为1.02×10~-11 TCID50/ml,与传统的N-PCR方法相同,较RT-qPCR方法灵敏25倍。该方法检测特异性好,与其他常见的呼吸道病毒未发生交叉反应。616例临床标本检测结果显示,143例OTNRT-PCR检测为阳性而RT-qPCR检测为阴性的标本经过测序OTNRT-PCR产物证实为真阳性。结论:OTNRT-PCR方法检测RSV感染比RT-qPCR更敏感。第三部分多重一步法巢式实时荧光定量PCR检测14种呼吸道病毒方法的建立及应用目的:多重实时荧光定量PCR(multiplex real time PCR,mRT-qPCR)普遍应用于临床实验室检测呼吸道病毒感染,然而,大多数报道的多重检测呼吸道病毒的方法灵敏度有限。本研究利用锁核酸(locked nucleic acid,LNA)修饰外引物首先建立了单管多重一步法巢式实时荧光定量PCR(multiplex one-tube nested real-time PCR,mOTNRT-PCR)检测呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)、人鼻病毒(human rhinovirus,HRV)和人偏肺病毒(human metapneumovirus,HMPV)的方法,进而建立了5管mOTNRT-PCR同时检测14种呼吸道病毒的方法。方法:采用质粒标准品评估mOTNRT-PCR方法的灵敏度和重复性,采用常见呼吸道病毒进行特异性评价,临床标本用于评估mOTNRT-PCR方法的临床检测效能,并与单重的实时荧光定量PCR(real time PCR,RT-qPCR)方法进行比较。结果:本研究所建立的单管mOTNRT-PCR检测RSV、HRV和HMPV的分析灵敏度均为5拷贝/反应,5管mOTNRT-PCR检测14种呼吸道病毒的分析灵敏度范围为2-20拷贝/反应。该方法检测特异性好,与其他常见的呼吸道病毒未发生交叉反应。临床标本检测结果显示,33例单管mOTNRT-PCR检测为阳性而RT-qPCR检测为阴性的标本经过测序文献报道的传统两步巢式PCR(two-step nested PCR,N-PCR)产物证实为真阳性。35例5管mOTNRT-PCR检测为阳性而RT-qPCR检测为阴性的标本经过测序文献报道的N-PCR产物证实为真阳性。结论:和RT-qPCR相比,mOTNRT-PCR是更灵敏的高通量检测14种呼吸道病毒的方法。