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1.目的:通过体内实验,建立大鼠椎间盘退变模型,予高中低浓度淫羊藿苷口服,按照实验时间点,通过Western blot和Real-time PCR法检测炎性因子IL-1β,IL-6的表达情况,并利用MRI观察椎间盘退变程度、HE染色观察椎间盘形态及免疫组化染色法检测椎间盘髓核(nucleus pulposus,NP)内细胞外基质Agg,coⅢ表达情况。体外实验检测淫羊藿苷对大鼠退变髓核细胞分泌炎性因子IL-6、IL-lp以及髓核细胞增殖、细胞外基质Agg,coⅢ的影响。通过体内、体外实验明确淫羊藿苷是否影响大鼠退变髓核细胞分泌炎性因子,进而延缓椎间盘退变。2.方法:2.1体内实验将60只SD大鼠随机分为5组:假手术组(Sham)、椎间盘退变组(IDD)及低中高浓度淫羊藿苷(ICA)组(ICAL,ICAM,ICAH),每组12只。采用穿刺大鼠尾椎间盘法制备IDD模型。术后对各组大鼠灌胃。ICA组分别灌胃ICA(25,50,100 mg/kg.d),Sham及IDD组给予等量生理盐水灌胃。术后2w及6w将大鼠麻醉进行MRI检查。术后2w及6w进行取材,用Western blot和Real-time PCR法检测炎性因子IL-1β,IL-6的表达情况;HE染色观察椎间盘形态;免疫组化染色观察NP内细胞外基质Agg,coⅢ表达情况。2.2体外实验将Sham提取的NP细胞标记为对照组(Control),IDD组提取的NP随机均分为4组(IDD、ICAL、ICAM及ICAH),ICA组用不同浓度ICA(10,20,40μM)处理24h,Control与IDD组则加入等量培养基。采用CCK-8测定NP细胞的增值能力。细胞免疫荧光,通过成像系统观察采集图像。收集各组NP细胞用于Western blot和Real-time PCR检测IL-1β,IL-6表达量,用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测收集上清液中IL-1β,IL-6水平。3.结果3.1 ICA可以抑制IL-1β,IL-6表达,促进Aggrecan,CollagenⅡ表达术后2w及6w两个时间点,Western blot和Real-time PCR结果均显示IDD组NP组织中IL-1β,IL-6表达量高于Sham及各浓度ICA组,而免疫组化显示IDD组Aggrecan,CollagenⅡ的表达量则低于其它组,表明IDD过程中炎症因子IL-1β,IL-6表达上调及胞外基质AggrecaⅡ,CollagenⅡ表达下调;ICA可以抑制IL--1β,IL-6表达,促进Aggrecan,CollgenⅡ表达。3.2 ICA可减轻大鼠椎间盘穿刺引起的退变7.0T MRR图像所示,比较IDD组与ICAM组穿刺椎间盘的T2加权信号强度:术后2w,,ICAM组信号强于IDD组;术后6w,IDD组信号消失,ICAM组则无明显改变。ICAM组Pfirrmann MRI等级评分(表明椎间盘退变程度)明显低于IDD组。术后6w的的E染色显示,与Shhm组相比,IDD组椎间盘退变严重,纤维环破裂呈断层状,层间空隙增宽,椎间盘内NP组织体积较小,形态不规则排列无序,NP细胞数量大量较少,形态呈类软骨样细胞样改变;而ICAA组在细胞外基质含量、纤维环及NP细胞形态方面均优于IDD组。3.3 ICA促进退变NP细胞增殖据文献报道分别给予不同浓度ICA(10,20及44μM)处理ICA组NP细胞。采用CK-8法测定NP细胞的增殖活性。结果显示IDD组NP细胞增殖力明显低于control及ICA组,表明ICA促进退变NP细胞增殖。3.4.ICA抑制NP细胞IL-1β,IL-6表达体外实验中,Real-time PCR及ELSIA结果显示:与Control组相比,IDD组NP细胞IL-1β,IL-6表达显著上调。ICA处理后与IDD组比较,NP细胞L--1,,L-6表达显著下调(P<0.05)。免疫荧光显示:与IDD组相比,,ICA组NP细胞核及细胞质上聚集的的IL-1β、IL-6荧光强度更弱。3.5.ICA抑制胞外基质Aggrecan,Collagen Ⅱ降解根据Western blot及Real-time PCR结果所示,与与control组相比,IDD组NP细胞外质Aggrecan和和collagenⅡ表达水平显著降低,,而ICA处理后可以提高Aggrecan和和collagenⅡ表达水平。4.结论:淫羊藿苷可以减轻体内大鼠椎间盘退变,促进退变髓核细胞增殖,并抑制炎症因子表达以及细胞外基质降解,因此可能成为治疗椎间盘退变的药物。