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目的随着社会老龄化现象日益加重,老年性痴呆(AD)正成为世人关注的重要问题,其患病率和发病率随着年龄的增长呈指数上升,而其高患病率对身体、心理及经济造成影响,不仅影响患者,而且还会影响护理人员、患者的家人和朋友、医疗保健系统乃至整个社会。因此,加强对AD的病因、发病机制的研究,寻求有效的防治措施和药物有着极其重要的临床价值和现实意义。本课题旨在阐释AD基本病机基础上探讨治疗AD的基本大法,并在成功建立目前公认的AD体外模型基础上,观察补肾化痰益智法治疗AD的作用及机制,为中医药治疗AD的深入研究提供理论基础和实验依据。方法1.理论探讨：分析整理有关AD的古今文献,归纳中医学对AD病因病机的认识,探讨肾虚、痰阻与智(志)的关系,阐释AD发病的基本病机和治则治法,并筛选治疗AD的有效方药,探讨补肾化痰益智法治疗AD的作用机理。2.实验研究：课题采用培养BV-2和PC12细胞株作为体外小胶质细胞和神经元模型。(1)运用2.5mmol/L孵育3d的Aβ1-42作用于BV-2细胞,制作AD小胶质细胞模型,同时用补肾化痰益智方含药血清进行干预,以吲哚美辛为对照。ELISA法检测细胞释放IL-Iβ、IL-6、TNF-α的情况,RT-PCR法检测IL-1βmRNA的表达,观察补肾化痰益智法对BV-2细胞分泌炎性细胞因子的影响,及其在mRNA水平对IL-1β表达的影响,探讨其抗炎机理。免疫细胞化学法及Western Blot法观察BV-2细胞NF-κB蛋白的表达,免疫荧光法检测COX-2的表达,从分子生物学水平,探讨补肾化痰益智法对炎性信号通路中的关键蛋白NFκB、COX-2表达的影响,以探讨其作用机理。(2)运用孵育3d的2.5mmol/LAβ1-42作用于PC12细胞,制作AD神经元细胞模型,并用补肾化痰益智方含药血清进行干预,以吲哚美辛为对照。镜下观察细胞形态,MTT法检测PC12细胞存活率,观察补肾化痰益智方对神经元细胞保护作用。RT-PCR法检测APPmRNA的表达,观察补肾化痰益智方抗Aβ神经毒性作用,以探讨其作用机制。结果1.补肾化痰益智法对AD细胞模型释放炎性因子的影响模型组IL-1β、IL-6、TNF-α浓度明显升高,与正常组比较,具有显著统计学差异(P<0.01)。与模型组比较,治疗各组都能降低IL-1β、IL-6、TNF-α的表达,且有显著性差异(P<0.01)。补肾化痰益智组与吲哚美辛组比较,能够更有效抑制IL-1β的表达(P<0.05)；但在减少IL-6的表达中,效果不如吲哚美辛组(P<0.05)；对于TNF-α的表达,则无统计学差异(P>0.05)。2.补肾化痰益智法对AD细胞模型IL-1βmRNA表达的影响RT-PCR法测定不同组BV-2细胞IL-1βmRNA的表达,灰度分析结果显示,模型组IL-1βmRNA表达明显增加,与正常组比较,有显著统计学差异(P<0.01)。与模型组比较,治疗各组均能减少IL-1βmRNA的表达,具有显著性差异(P<0.01)。而与西药吲哚美辛组比较,补肾化痰益智方更能显著调节IL-1βmRNA基因的表达水平(P<0.05),这与上述ELISA法检测结果基本一致,说明补肾化痰益智法能够从基因水平调节IL-1βmRNA的表达,从而抑制BV-2细胞分泌炎性因子的作用。3.补肾化痰益智法对AD细胞模型细胞形态的影响模型组BV-2细胞在Aβ1-42作用2h后即可出现明显的形态学改变,细胞胞体变大,胞核大而圆,核仁明显；12h后多数细胞聚集成团,胞体变为梭形,胞体伸出一个或多个较长的枝状突起,甚至相互交织、缠绕,细胞间以突起互相连接、融合；胞浆大片、深度黄染,核周围明显的棕褐色颗粒；部分细胞呈强阳性表达,个别细胞肿大呈吞噬样,甚至有细胞死亡脱壁悬浮。这种作用一直维持到24h。补肾化痰益智组BV-2细胞在Aβ1-42作用2h左右贴壁,胞体圆形,单个,大小均匀,细胞胞浆清晰,胞核蓝色或淡蓝色,分枝状突起明显,未见明显的细胞变形。4.补肾化痰益智法对AD细胞模型NF-κB蛋白表达的影响免疫细胞化学法和Western Blot法结果均显示,模型组BV-2细胞NF-κB蛋白高表达,与正常组比较,有显著性差异(P<0.01)。与模型组比较,两治疗组都能明显减少NF-κB蛋白的表达,具有统计学差异(P<0.01)。补肾化痰益智组降低BV-2细胞NF-κB蛋白表达的作用与吲哚美辛组无显著性差异(P>0.05)。5.补肾化痰益智法对AD细胞模型COX-2蛋白表达的影响模型组BV-2细胞COX-2蛋白高表达,与正常组比较,有显著性差异(P<0.01)。与模型组比较,各治疗组都能明显减少COX-2蛋白的表达,具有统计学差异(P<0.01)。补肾化痰益智组降低BV-2细胞COX-2蛋白表达的作用与吲哚美辛组无显著性差异(P>0.05)。6.补肾化痰益智法对AD细胞模型细胞形态及存活率的影响模型组PC12细胞贴壁缓慢,24h后数目明显减少,体积缩小,细胞变圆脱落,或成片漂浮于培养基,培养基中碎片、颗粒物质增多,不清晰。补肾化痰益智组PC12细胞,背景清晰,细胞贴壁生长,24h铺满培养板底,细胞呈梭形或扁平。同时,2.5mmol/L聚集态Aβ1-42使细胞活力明显下降,各治疗组对Aβ1-42引起的细胞毒性有不同程度的保护作用。7.补肾化痰益智法对拟AD细胞模型APPmRNA表达的影响RT-PCR法对APPmRNA表达进行半定量分析发现,经Aβ1-42诱导各组APPmRNA表达上调,与正常组比较,差异有显著统计学意义(P<0.01)。与模型组比较,治疗各组能够不同程度降低其表达(P<0.01)；补肾化痰益智组较吲哚美辛组更为明显,有统计学差异(P<0.05)。结论一、肾虚则智不足,痰阻则清窍昏是老年性痴呆的基本病机,补肾化痰益智法是其基本且有效的治法。二、Aβ神经毒性与AD免疫炎性反应具有相关性。三、补肾化痰益智法能够有效抑制AD炎性信号通路相关蛋白NF-κB、COX-2的表达,阻断炎性反应过程。四、补肾化痰益智法能够调控炎性细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α及IL-1βmRNA的表达,从基因水平抑制炎性反应。五、补肾化痰益智法能够抑制APPmRNA的表达,降低毒性作用。六、补肾化痰益智法对神经细胞具有较好的保护作用。