一种新型的D1多巴胺受体通过耦联于Gq蛋白激活PLCβ/IP3信号级联反应而促进PI的水解被称为PI-耦联的新型多巴胺受体于最近被发现并广为报道。SKF83959作为PI-D1多巴胺受体的特异性激动剂，与经典的多巴胺受体激动剂不同的是它对cAMP/PKA信号途径并不产生影响，我们以往的实验研究表明SKF83959在Ca2+存在的条件下可以影响脑片CaMKII，Cdk5的表达，但其具体的作用机制尚未完全阐明，对其与神经元细胞内钙离子及相关信号转导路径的尚未研究，且SKF83959对相关神经退行性疾病的药效学研究也进行的很少。 本文拟在海马神经元上研究SKF83959对海马神经元细胞内Ca2+及其相关信号转导通路的影响，并对其在Aβ25-35所致的海马神经元损伤作用中是否具有保护作用进行探讨，进一步阐明SKF83959的作用机制，并为其在神经退行性疾病中的应用前景提供可靠的实验依据。 第一部分SKF83959对培养大鼠海马神经元细胞内钙信号通路的影响 §1SKF83959对原代培养海马神经元[Ca2+]i的影响 以Fura-2/AM为荧光探针，细胞内荧光钙成像的方法检测SKF83959对培养海马神经元[Ca2+]i的影响。 0.1-30μmol/LSKF83959浓度依赖性地增加海马神经元[Ca2+]i，给予1μmol/LSKF83959后，2.0min即可引起[Ca2+]i的增加，5±2.1min使[Ca2+]i升高达最大值，其平均升高幅度约为96.0％±5.6％(P＜0.05vscontrol)。 §2SKF83959引起海马神经元[Ca2+]i升高中Ca2+来源的研究 通过改变细胞内外液中Ca2+含量，并利用不同的离子通道拮抗剂，观察其对SKF83959升高培养海马神经元[Ca2+]i的影响。 给予1μmol/Lthapsigargin耗竭细胞内钙库后，1μmol/LSKF83959不再引起[Ca2+]i变化。给予无Ca2+细胞外液时，1μmol/LSKF83959仍能引起[Ca2+]i增加，但升高幅度明显低于有钙细胞外液中的反应(52.0％±4.1％，P＜0.05vs1μmol/LSKF83959)，重新加入Ca2+到细胞外液后，[Ca2+]i进一步升高。而预先给予10μmol/Lnifedipine和CdCl2(L-型钙通道拮抗剂)，[Ca2+]i仅分别升高48.0％±3.0％和40.0％±5.0％(P＜0.01vs1μmol/LSKF83959)，50μmol/LAPV(NMDA受体拮抗剂)和10μmol/LCNQX(AMPA受体拮抗剂)可部分拮抗[Ca2+]i的增加，仅分别升高[Ca2+]i45.0％±4.8％和68.0％±7.0％(P＜0.05vs1μmol/LSKF83959)，而2μmol/LTTX则不影响SKF83959升高[Ca2+]i的反应。 §3SKF83959升高培养海马神经元[Ca2+]i作用机制的探讨 应用不同第二信使拮抗剂，探讨1μmol/LSKF83959升高原代培养海马神经元[Ca2+]i的作用机制。 预先给予不同第二信使拮抗剂之后再给予1μmol/LSKF83959时，100nmol/LSKF83566(D1多巴胺受体拮抗剂)完全拮抗[Ca2+]i的增加(P＜0.05vs1μmol/LSKF83959inACSF)，S(-)-raclopride(D2多巴胺受体拮抗剂)则几乎不产生任何影响，U-73122(PLCβ受体拮抗剂)和ATP(IP3受体拮抗剂)也表现出完全的拮抗效应(P＜0.05vs1μmol/LSKF83959)，U-73343(U-73122无活性同构物)和bucladesine(cAMP拟似激动剂)则不对SKF83959升高[Ca2+]i的反应产生影响。而mesulergineHCl(5-HT1A受体拮抗剂)，prazosin(α1-肾上腺素受体拮抗剂)和scopolamine(m-Ach受体拮抗剂)也未能阻止1μmol/LSKF83959所引起的[Ca2+]i升高。 第二部分SKF83959预处理对Aβ25-35致海马神经元损伤的作用及机制研究 §1SKF83959预处理对Aβ25-35致海马神经元细胞毒性的作用研究 培养原代海马神经元细胞，设置空白对照组(正常培养海马神经元)，模型组(25μmol/LAβ25-35)，药物预处理组(SKF83959预处理组)和阳性药物LiCl对照组，分别检测海马神经元凋亡率。 MTT实验结果显示SKF83959和阳性药物LiCl预处理6h后均显著降低老化的25μmol/LAβ25-35造成的海马神经元损伤，增加海马神经元存活率，对其细胞培养液上清中LDH含量检测结果也与MTT趋向一致。 AnnexinV/PI匹配染色流式细胞仪检测细胞凋亡率，发现SKF83959预处理组和阳性对照药LiCl处理组均能降低25μmol/LAβ25-35造成的神经元凋亡(P＜0.05vs25μmol/LAβ25-35)。Hoechst33342荧光染色法计数原代培养海马神经元凋亡率，与对照组相比，发现Aβ25-35明显增加海马神经元的凋亡率(32.1％±3.4％vs3.9％±0.7％，P＜0.01)，而20μmol/LSKF83959和10mmol/LLiCl预处理6h后可明显减少Aβ25-35所致神经元凋亡细胞数目的增加，分别降低至13.0％±0.9％和8.8％±0.7％(P＜0.05vs25μmol/LAβ25-35)。 §2Westernblot检测培养海马神经元细胞内p-GSK3β9ser的表达 Westernblot免疫印迹法检测各组海马神经元细胞p-GSK3β9ser蛋白的表达，发现25μmol/LAβ25-35能显著降低p-GSK3β9ser的水平，而SKF83959和LiCl预处理6h后与模型组相比明显增加p-GSK3β9ser的磷酸化水平，提示SKF83959可能通过增加p-GSK3β9ser的活性而发挥保护作用。 小结 SKF83959通过激活PI-D1多巴胺受体而激活PLCβ/IP3信号转导通路，引发海马神经元细胞内钙库中Ca2+释放而增加[Ca2+]i，细胞内增加的钙离子可能通过激活第二信使如PKC等而磷酸化L-型电压门控通道及NMDA受体门控通道，促进其开放而介导细胞外钙离子内流维持[Ca2]i进一步升高。 在老化的25μmol/LAβ25-35作用24h建立的海马神经元损伤模型中，SKF83959和LiCl预处理6h均可显著减少Aβ25-35所造成的损伤，初步研究结果表明SKF83959可能通过增加p-GSK3β9ser磷酸化，抑制GSK3β的活性而发挥保护作用。