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研究目的1.探讨miR-199a-3p对食管鳞癌细胞周期及迁移能力的影响及分子机制。2.探讨下调食管鳞癌细胞中Rictor表达后,PI3K/Akt/mTOR信号通路抑制剂对食管鳞癌细胞周期及迁移能力影响的变化。研究方法1.不同食管鳞癌细胞株中miR-199a-3p的表达情况。分别提取食管鳞癌ECa109、EC9706、KYSE450、KYSE790 和 TE1 细胞总 RNA,并反转录成 cDNA,qRT-PCR法分别检测5株细胞中miR-199a-3p的表达量。2. miR-199a-3p对食管鳞癌细胞周期及迁移能力的影响。培养食管鳞癌细胞株ECa109、EC9706 和 KYSE450,对其分别转染 miR-199a-3p mimics 及miR-199a-3p negative control,6h后在荧光显微镜下观察转染效率;48 h后采用qRT-PCR法分别检测转染前后细胞中miR-199a-3p的表达水平,然后分别采用流式细胞术、划痕实验及transwell实验检测转染前后细胞周期及细胞迁移能力的变化。3. miR-199a-3p对食管鳞癌细胞mTORC2信号通路相关蛋白表达的影响。收集转染 miR-199a-3p mimics、miR-199a-3p mimics negative control 72h 及未转染的食管鳞癌细胞并分别提取总蛋白,采用Western blot方法检测mTOR、Rictor、p-Akt(S473)、PI3K、p-Akt(T308)等mTORC2信号通路相关蛋白的表达情况。4.下调食管鳞癌细胞中Rictor表达后,PI3K/Akt/mTOR信号通路抑制剂对食管鳞癌细胞周期及迁移能力影响的变化。分别应用RAD001、LY294002和PP242处理筛选的稳定表达Rictor-shRNA载体的ECa109细胞及对照组细胞,然后分别采用流式细胞术和transwell方法检测处理前后细胞周期及迁移能力的变化。研究结果1. miR-199a-3p 在 5 株不同食管鳞癌(ECa109、EC9706、KYSE450、KYSE790、TE1)细胞中都有表达,但表达水平无统计学差异。2.ECa109、EC9706 和 KYSE450 分别转染 miR-199a-3pmimics 后,荧光显微镜下显示具有绿色荧光的细胞数较多,说明miR-199a-3p mimics己成功转入细胞中。与未转染组细胞及阴性对照组细胞相比,转染miR-199a-3pmimics后细胞中miR-199a-3p表达量显著增加,G1期细胞数明显增高,细胞相对迁移率及迁移细胞数明显降低。3.提高 ECa109、EC9706 和 KYSE450 细胞中 miR-199a-3p 表达后,mTOR 和Rictor的蛋白表达水平显著降低,而p-Akt(S473)、PI3K和p-Akt(T308)的蛋白表达水平显著增加。4.下调Rictor表达后,LY294002和PP242均使食管鳞癌G2期细胞数增加的更加明显,同时RAD001、LY294002和PP242也均使食管鳞癌细胞迁移数下降的更加显著。结论1. miR-199a-3p能阻滞食管鳞癌的细胞周期进程,抑制食管鳞癌细胞的迁移,且其分子机制可能与其调控mTORC2信号通路有关。2.下调Rictor表达能增强PI3K/Akt/mTOR信号通路抑制剂对食管鳞癌细胞周期的阻滞作用和对细胞迁移的抑制作用。