研究背景与目的:鼻咽癌是头颈部常见恶性肿瘤,2020年全球癌症流行病学数据显示,我国鼻咽癌的年发病率和死亡率分别为每10万人3.00和1.60,约占全球新发病例的46.9%和死亡病例的43.0%,是全球鼻咽癌的高发地区之一。同时,由于鼻咽癌起病隐匿、鼻咽部解剖位置特殊、肿瘤细胞生长快、易侵袭等特点,大多数患者在确诊时已为中晚期。虽然目前鼻咽癌治疗普遍采用化学药物治疗、放射治疗及靶向药物治疗相结合的综合性治疗策略,但晚期患者5年生存率提高仍然有限,仅为40%左右。因此,鼻咽癌已经成为我国社会普遍关注的重大公共健康问题之一。根据患者个体遗传学背景结合其肿瘤生物学行为特征,制定个体化治疗策略已经成为当前鼻咽癌治疗发展的重要方向。对鼻咽癌进展机制的深入研究将有助于寻找新的可用于鼻咽癌临床诊断和治疗的有效靶点。肿瘤的发生、发展受到肿瘤驱动信号通路的调控,而相关肿瘤驱动信号通路的激活是基因表达持续紊乱的结果。细胞通过基因的有序表达维持其正常的生物学行为,而RNA水平调控、表观遗传学调控、蛋白质水平调控是介导基因正常、有序表达的关键。近年来,RNA水平调控被证实参与细胞恶性转化过程,已成为当前肿瘤学领域的研究热点。由于不能编码蛋白质,Lnc RNA早先并未获得太多的关注。随着对人类基因表达及调控研究的深入,越来越多的证据表明Lnc RNAs通过与DNA、RNA、蛋白质分子的相互作用,在染色质结构重塑、转录产物的剪接编辑、m RNA稳定性、干细胞多向分化等细胞生理过程中发挥关键作用,其介导的基因表达调控是一种非常重要的RNA水平调控途径。Lnc RNA CASC9（cancer susceptibility candidate 9）在2015年首次在食管癌中被报道,其后又在胃癌、乳腺癌等恶性肿瘤中被证实与肿瘤的发生、发展有关。截止目前,有关CASC9与鼻咽癌相关研究还十分有限。有研究报道,在鼻咽癌组织中CASC9呈高表达并与患者的不良预后呈正相关,但其发挥的具体作用及机制尚不明确。本研究旨在进一步验证长链非编码RNA CASC9在鼻咽癌组织内的表达水平及与鼻咽癌患者预后的相关性,并初步探索其参与鼻咽癌发生、发展的作用及分子机制。本课题包括以下四个部分:第一部分:鼻咽癌差异表达基因与CASC9的生物信息学分析;第二部分:CASC9在鼻咽癌中的表达及临床意义;第三部分:CASC9在鼻咽癌中的功能研究;第四部分:CASC9影响鼻咽癌发生发展的机制研究。第一部分鼻咽癌差异表达基因与CASC9的生物信息学分析方法:1.从TCGA官网下载头颈部鳞癌基因表达数据和临床信息,筛选呈差异表达Lnc RNA。2.通过回归分析筛选与头颈部鳞癌患者预后相关的差异表达Lnc RNA。3.利用在线工具GEPIA（http://gepia.cancer-pku.cn/）分析CASC9在头颈部鳞癌中的表达情况,以及与预后的相关性。4.从Sequence Read Archive Database下载鼻咽癌肿瘤的RNA-Seq测序数据集并筛选呈差异表达Lnc RNA。结果:1.在头颈部鳞癌中呈差异表达的Lnc RNA共有889个,通过回归分析,得到12个与患者预后相关最为显著的Lnc RNA,其中包括表达显著上调的CASC9。2.头颈部鳞癌组织中CASC9呈现高表达,与患者不良预后相关。3.在两个数据集中均出现差异表达的鼻咽癌Lnc RNA共有274个,其中包括表达显著上调的CASC9。第二部分CASC9在鼻咽癌中的表达及临床意义方法:1.收集临床样本,通过q RT-PCR的方法检测鼻咽癌组织中CASC9基因的表达水平并与鼻咽癌患者预后进行相关性分析。2.通过q RT-PCR法检测人鼻咽癌细胞系HNE-1、HONE-1、CNE-2、5-8F中CASC9的表达水平。结果:1.NPC组织中CASC9高表达,与患者的不良预后相关。2.CASC9在四种鼻咽癌细胞系中均呈现高表达。第三部分CASC9在鼻咽癌中的功能研究方法:1.通过MTT法、克隆形成检测沉默及过表达CASC9后的鼻咽癌细胞的增殖。2.通过流式细胞术法检测沉默及过表达CASC9后的鼻咽癌细胞的周期分布。3.通过Transwell法、划痕实验检测沉默及上调CASC9后的NPC细胞的迁移、侵袭。4.通过MTT法检测沉默及过表达CASC9后的鼻咽癌细胞对顺铂及紫杉醇的药物敏感性。5.通过Western Blot法检测沉默及过表达CASC9后鼻咽癌细胞中Ki67、Cyclin D1、Cyclin E、MMP2、MMP9、MDR1、MRP1的蛋白表达。6.通过裸鼠皮下成瘤研究敲低CASC9后肿瘤体内生长情况,免疫组化检测肿瘤组织中Ki67蛋白表达水平。结果:1.沉默CASC9可以抑制鼻咽癌细胞的增殖,过表达CASC9可以促进鼻咽癌细胞的增殖。2.沉默CASC9可以诱导鼻咽癌细胞G0/G1期阻滞,过表达CASC9可以促进鼻咽癌细胞周期。3.沉默CASC9可以抑制鼻咽癌细胞的迁移和侵袭,过表达CASC9可以促进鼻咽癌细胞的迁移和侵袭。4.沉默CASC9可以提高鼻咽癌细胞对顺铂及紫杉醇的药物敏感性,过表达CASC9可以降低鼻咽癌细胞对顺铂及紫杉醇的药物敏感性。5.沉默和过表达CASC9可以调控鼻咽癌细胞中Ki67、Cyclin D1、Cyclin E、MMP2、MMP9、MDR1、MRP1的蛋白表达水平。6.沉默CASC9可以抑制裸鼠体内鼻咽癌的生长,引起肿瘤组织中Ki67蛋白表达水平下降。第四部分CASC9影响鼻咽癌发生发展的机制研究方法:1.通过FISH实验检测CASC9在鼻咽癌细胞中的亚定位。2.生物信息学预测CASC9、mi R-497-5p靶基因。3.双荧光素酶报告基因实验验证CASC9、mi R-497-5p的靶基因。4.q RT-PCR法检测敲低及过表达CASC9后mi R-497-5p的表达,以及敲低及过表达mi R-497-5p后Wnt3a的表达情况。5.通过克隆形成、流式细胞术、划痕实验、Transwell法和Western Blot检测回复mi R-497-5p表达后NPC细胞增殖、周期、迁移、侵袭情况及其相关蛋白的表达情况。6.通过Western Blot检测过表达mi R-497-5p后鼻咽癌细胞中Wnt3a/β-catenin通路相关蛋白表达水平。结果:1.FISH表明CASC9分布于细胞核和细胞质中。2.生物信息学分析预测显示mi R-497-5p为CASC9的靶基因,Wnt3a为mi R-497-5p的靶基因。3.双荧光素酶报告基因实验验证mi R-497-5p为CASC9的靶基因,Wnt3a为mi R-497-5p的靶基因。4.q RT-PCR法结果显示CASC9负向调控mi R-497-5p的表达,mi R-497-5p负向调控Wnt3a的表达。5.回复实验显示敲低mi R-497-5p的表达可逆转敲低CASC9对NPC细胞的增殖、周期、侵袭、迁移以及相关蛋白表达的调控作用。6.Western Blot结果显示过表达mi R-497-5p后影响了Wnt3a/β-catenin通路相关蛋白表达水平。结论:1、CASC9在鼻咽癌中呈高表达,且与患者不良预后相关;2、干扰CASC9的表达可能影响鼻咽癌细胞增殖、侵袭、迁移以及裸鼠体内成瘤的能力,并可能改变对化疗药物的敏感性;3、CASC9可能通过mi R-497-5p/Wnt3a/β-catenin通路调控鼻咽癌细胞的恶性生物学行为。