病害一直是困扰水产养殖业的最大问题，研究水产养殖品种的抗病相关基因，利用其本身的抗病因子加强抗病力，发展新的免疫防治对策，取代或减少药物使用是水产养殖品种病害防治的根本。本论文从细菌刺激的中国对虾中克隆了一个氧位一甲基转移酶基因，从细菌刺激的泥鳅中克隆了一个CD59基因，并对这两个基因进行了表达模式和功能研究，结果如下： 一、首次克隆了中国对虾COMT基因 儿茶酚一氧位-甲基转移酶(Catech01-O-methyltransferase，简称COMT,E.C.2.1.1.6)是一种氧位．甲基转移酶。尽管氧位．甲基转移酶转甲基的化学机制都是一样的，但由于甲基受体分子的不同，氧位．甲基转移酶的种类也有所不同。动物有两种氧位-甲基转移酶被广为研究：一种是法呢酸一氧位一甲基转移酶(farnesoic acid-O-methyltransferase，简称FAMeT)：另一种就是COMT。通过对甲壳动物：FAMeT的研究得知，FAMeT是催化法呢酸甲基化反应生成法呢酸甲酯的氧位-甲基转移酶，对甲壳动物的生长、卵巢发育和蜕皮具有调控作用。COMT可以催化S腺苷蛋氨酸的一个甲基转移到含儿茶酚结构的底物分子上，形成甲基化的产物，所以，COMT可以灭活儿茶酚胺类以及其它的儿茶酚型化合物，当然，也包括含有儿茶酚结构的有毒物质和临床药物。 自从1958年人的COMT被首次发现以来，COMT在脊椎动物和无脊椎动物中都有发现，然而，关于甲壳类COMT的研究还未见报道。 本文利用抑制性消减杂交技术(SSH)和SMART cDNA方法，克隆了中国对虾COMT基因，该基因全长cDNA序列已提交给GenBank，登录号为DQ091255。中国对虾COMT基因全长917bp，含有一个完整的开放阅读框，编码的成熟肽由221个氨基酸组成，其理论分子量是24572.06 Da，等电点是5.27，推测该成熟肽有10个磷酸化的氨基酸位点，不具信号肽，说明中国对虾COMT不分泌到循环的血液中，而是依赖特定氨基酸的磷酸化起调控作用。另外，推测中国对虾COMT中第18-221个氨基酸残基构成了一个保守区，该保守区属于甲基转移酶-3家族。 甲基转移酶-3家族成员很多，包括COMT、细菌氧位一甲基转移酶(简写为OMT)和咖啡酰辅酶A-氧位-甲基转移酶(简写为CCoAOMT)。通过氨基酸序列比对发现，本文克隆的中国对虾COMT基因与人和其它的哺乳动物的COMTS具有较高的的同源性，而与甲壳动物十足目的FAMeTs没有重要的序列相似性。系统发育分析也将本文克隆的中国对虾COMT基因与其它物种的COMTS归为同一类群，而与甲壳动物的FAMeTS分属不同类群，依此推论中国对虾氧位．甲基转移酶基因不属于FAMeTS，而 可能为COMTS的一个新成员。 二、中国对虾COMT基因表达研究 用Northern blot在细菌刺激的和正常的对虾血细胞、肝胰腺、心脏、胃、鳃、肠和卵巢中均检测到中国对虾COMT基因的单一表达带，而且信号强度不同，心脏和鳃中的信号最弱，肝胰腺中的信号最强，另外，在细菌刺激的肝胰腺、胃中呈上调表达。 原位杂交结果显示，中国对虾COMT基因的mRNA在正常对虾的血细胞、肝胰腺、胃、肠和卵巢中均有转录，而正常对虾的心脏和鳃中未检测到中国对虾COMT基因的转录本。显然，中国对虾COMT基因在对虾组织中是广为分布，在对虾的血细胞、肝胰腺中高表达，在对虾的心脏和鳃中低表达，而且在细菌刺激的肝胰腺、胃中呈上调表达，这些结果表明中国对虾COMT基因可能对对虾有多种功能，尤其可能参与了对细菌感染的免疫反应。 三、中国对虾COMT重组表达与功能研究 为了验证中国对虾COMT基因的功能，用合成的基因特异引物Met-Ex-F1与Met-Ex-R1，将中国对虾COMT基因的表达框(ORF)扩增并克隆到原核表达载体pET-30a(+)中，构建了重组表达质粒(Comt/pET-30a(+)，并成功地在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中进行了重组蛋白的表达。表达的重组蛋白为可溶性的，经His-Bind亲和层析柱纯化得到了高纯度的重组蛋白。SDS-PAGE检测该重组蛋白的分子量约为30 kDa，与预计的重组蛋白的分子量一致。同时，用高效液相色谱．质谱联用(HPLC-MS)技术检测到了纯化的中国对虾COMT重组蛋白甲基化底物二羟苯甲酸形成的产物-香草酸，从而证明了纯化的中国对虾COMT重组蛋白具有儿茶酚-氧位-甲基转移酶(COMT)的活性。该结果也进一步证明，本文克隆的中国对虾氧位-甲基转移酶基因就是中国对虾COMT基因。 四、首次克隆了泥鳅CD59基因 CD59是一种重要的补体调节蛋白，可以抑制膜补体复合物(MAC)的形成。CD59若在人体异常表达，容易引起血管系统疾病，并与炎症和异体器官移植的超急排阻都有联系。目前，CD59在人及多种哺乳动物中研究较多，而且也开展了软骨鱼CD59的研究，但关于硬骨鱼类CD59基因结构及表达模式的研究还未见报道。 本文利用同源克隆的方法，首次克隆了泥鳅CD59基因。基因全长611bp，包含一个282bp开放阅读框(ORF)，编码94个氨基酸，其中有10个半胱氨酸，用于形成5个二硫键，还有预测的2个N端酰基化位点(12-17：GLVVSG；48-53：GCAAAR)，1个磷酸化位点(69-72：SDCE)和3个糖基化位点。在开放阅读框5’端的第178bp后面 有一个152bp的内含子插入。 五、泥鳅CD59基因表达和组织分布的研究 利用Northem blot、RT-PCR和原位杂交等实验技术研究了泥鳅CD59基因的mRNA在组织中的表达和分布。 Northern blot结果显示，在刺激和不刺激泥鳅的血细胞、肝胰脏和肠组织中均有一条约500nt的杂交带，而且刺激泥鳅的肝胰脏和肠中的杂交信号比正常泥鳅的肝胰脏和肠中的杂交信号强得多。在刺激和不刺激泥鳅的脑、肾脏、鳃、卵和肌肉以及不刺激泥鳅的血细胞中没有杂交信号。 本文还采用了RT-PCR方法对泥鳅CD59基因的mRNA在泥鳅肝胰脏和肠中的表达进行了研究，得到了与Northern blot一致的结果：刺激与不刺激泥鳅的肝胰脏和肠中均存在CD59基因，而且刺激泥鳅组织中的基因表达量明显地比正常泥鳅组织中的多。 原位杂交结果显示，杂交信号在肝胰脏的胰腺区、肠壁最内层的粘膜层和最外层的浆膜层较强，而在粘膜下层很弱。在血细胞中着色最强的是小的白血细胞，红血细胞几乎没有着色。 以上实验结果表明，泥鳅CD59基因在肝胰脏、肠和血细胞中表达，而且，肝胰脏和肠中的表达量明显地高于血细胞中的表达量，另外，细菌刺激以后，泥鳅cD59基因在肝胰脏和肠中上调表达，推测泥鳅CD59参与了对细菌感染的免疫防御反应。 六、泥鳅CD59基因原核表达研究 本文还利用C1359基因表达引物CD59-ExpFl和C1359-ExpRl从刺激的泥鳅肝胰脏Cdna中扩增了C1359成熟肽基因片段，将其插入Pgex-4T-1载体，构建了表达载体cd59/Pgex-4T-1，并在E.coli表达菌株BL21(DE3)成功地表达了目的蛋白，经过对纯化方法的改进，从G1utathione Sepharose 4B亲和层析柱纯化出了泥鳅GST-CD59融合蛋白，为泥鳅CD59的功能研究奠定了良好的基础。