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木质纤维素作为一种可再生资源可用于生产生物燃料或其它高附加值产品。然而木质纤维素中的纤维素以共价键连接,被半纤维素和木质素包裹,以及纤维素自身的微纤维交联导致其很难被纤维素酶所降解,也很难将其转化为可发酵糖。对木质纤维素进行预处理可破坏其中的氢键,增强纤维素酶的可及性。然而常规的酸碱,离子液体等预处理不仅增加了生产成本,而且易导致严重的环境污染。嗜热菌Caldicellulosiruptor saccharolyticus来源的天然双催化域耐热纤维素酶CelA可直接水解结晶纤维素（Avicel）。基于该发现,将嗜热菌来源的单催化域纤维素酶进行双催化域重构,以期获得降解天然木质纤维素的双催化域耐热纤维素酶。本文将来源于C.saccharolyticus的第5家族外切葡聚糖酶（Exo5）基因分别和第5家族内切葡聚糖酶（Endo5）、第1家族β-葡萄糖苷酶（Bgl1）基因连接并插入表达载体pET28a。为进一步提高对天然底物的降解,在两个催化结构域之间引入不同碳水化合物结合模块（CBM）,且在大肠杆菌Escherichia coli中成功实现了表达,得到了一系列双催化域耐热纤维素酶。测试了融合酶的最适温度、最适pH、热稳定性、pH稳定性,SDS、EDTA和金属离子对融合酶活力的影响及底物特异性等酶学特性。融合酶Bgl1-CBM3c-2CBM3b-Exo5（Bgl1-3CBM-Exo5）、Bgl1-2CBM3b-Exo5（Bgl1-2CBM-Exo5）和Bgl1-CBM3b-Exo5（Bgl1-CBM-Exo5）具有β-葡萄糖苷酶和外切葡聚糖酶的活性。融合酶均可降解滤纸（FP）、Avicel、蒸汽预处理的水稻秸秆（SPRS）、水稻秸秆（RS）和小麦秸秆（WS）,其中对Avicel的活力高达34.476.4 U/μmol,是亲本CBM3b-Exo5活力的1.22.7倍。Bgl1-3CBM-Exo5对羧甲基纤维素钠（CMC-Na）的活力是Bgl1-CBM-Exo5的2.9倍,Bgl1-2CBM-Exo5的1.5倍。当添加终浓度为10 mM的MnCl2时,融合酶对CMC-Na的活力提高了128192%。此外,Bgl1-3CBM-Exo5的最适酶活温度与Bgl1相同为70℃,其他两种酶的最适酶活温度与亲本酶Exo5相同为80℃。融合酶的最适pH值与Exo5相同为4.5,相比Bgl1的最适pH值降低了1.0。融合酶Endo5-CBM28-CBM3b-Exo5（Endo5-2CBM-Exo5）、Endo5-CBM3b-Exo5和Endo5-CBM28-Exo5也均可降解FP、Avicel、SPRS、RS和WS。其中,Endo5-2CBM-Exo5对Avicel的特异性活力高达0.167 U/mg,比亲本酶Endo5-CBM28对Avicel的特异性活力提高了14.0倍。Endo5-2CBM-Exo5对CMC-Na的活力分别是Endo5-CBM3b-Exo5和Endo5-CBM28-Exo5的4.2和1.9倍。当添加终浓度为10 mM的MnCl2时,融合酶对CMC-Na的活力提高了121141%。此外,Endo5-CBM3b-Exo5的最适酶活温度为60℃,与Endo5相比降低了15℃。另两种融合酶的最适酶活温度与Exo5相同均为80℃。融合酶Endo5-2CBM-Exo5的最适pH值为4.0,Endo5-CBM3b-Exo5和Endo5-CBM28-Exo5与亲本Exo5最适pH值相同为4.5,与Endo5的最适pH值相比降低了1.01.5。结果表明,重构的双催化域耐热纤维素酶对木质纤维素的降解效率得到了提高,这为环境友好的木质纤维素转化、应用奠定了理论依据和实践基础。