缺氧导致细胞及组织损伤,从而引发癌症、心血管系统等多种疾病,研究机体中氧气（O₂）水平的异常情况,对于疾病的诊断、治疗和机制的研究均具有重要意义。因此,基础和临床研究中都迫切需要开发准确可靠的O₂定量检测技术。电子顺磁共振（Electronic Paramagnetic Resonance,EPR）也称电子自旋共振（Electron Spin Resonance,ESR）血氧测定法可用于O₂定量检测。与Clark电极、磁共振成像、磷光成像、化学发光等方法相比,其具有无创、实时、可重复及高灵敏度等优点。EPR技术的应用离不开EPR探针,全取代三苯甲基（tetrathiatriarylmethyl,TAM也称为trityl）自由基,是较为常见的一类EPR O₂探针,具有高灵敏度、高稳定性等优点。由于TAM自由基在生理p H条件下带负电荷,不易进入细胞内,因此仅适用于细胞外O₂水平检测,对TAM O₂探针进行化学结构修饰或纳米粒子装载后,可使其进入细胞内进行O₂水平测定。目前尚存一些问题,如制备流程较复杂、探针的水溶性较低或细胞毒性较强等。本研究拟采用制备工艺简便的脂质体纳米技术,封装一种水溶性的TAM自由基——CT-03,作为细胞内O₂探针。此外,CT-03的结构类似物CT02-H,用于细胞外O₂检测,并将CT-03脂质体（CT-03 LPs）和CT02-H联合用于同时定量检测人肝癌细胞Hep G2内外的O₂水平。目的:采用TAM自由基CT-03 LPs和CT02-H双探针实现Hep G2细胞内外O₂水平的检测。为TAM自由基在细胞水平的应用提供新思路。方法:1.细胞内O₂探针CT-03 LPs的性能研究（1）CT-03 LPs的制备与表征。采用薄膜分散法制备CT-03 LPs,检测其包封率、粒径、多分散指数（polydispersity index,PDI）及Zeta电位。（2）CT-03 LPs的稳定性研究。CT-03和CT-03 LPs分别溶于PBS中,终浓度均为20μM。在室温下检测3天内CT-03 LPs粒径、Zeta电位和浓度的变化;在37℃下检测5小时内CT-03和CT-03 LPs浓度的变化;并检测与500μM的BSA及1 m M的GSH等氧化还原物质反应后的EPR信号。（3）CT-03 LPs的细胞摄取量研究。20μM的CT-03和CT-03 LPs分别与Hep G2细胞共孵育1、2、3、4、5或7小时后,洗去未进入细胞的探针,检测细胞内CT-03及CT-03 LPs的浓度。（4）CT-03 LPs的O₂敏感性研究。分别将溶于PBS中的CT-03、CT-03 LPs或装载CT-03 LPs的Hep G2细胞悬浮液置于0、5、10、15及21%O₂的O₂/N₂混合气流下连续灌注,每个O₂含量下平衡5 min后记录EPR信号。测量其波峰与波谷间的EPR线宽,得到O₂浓度-EPR线宽曲线,其斜率表示氧气敏感性。（5）CT-03 LPs的细胞毒性研究。采用MTT法检测CT-03 LPs对Hep G2细胞活力的影响。2.细胞外O₂探针CT02-H的性能研究（1）CT02-H的稳定性研究。50μM的CT02-H溶于无血清的RPMI-1640细胞培养基中,在37℃下检测5小时内其浓度的变化;检测其在10%FBS的RPMI-1640细胞培养基中的EPR线宽,以及与1 m M的GSH等氧化还原物质反应后的浓度。（2）CT02-H的O₂敏感性研究。按同上方法检测O₂敏感性。（3）CT02-H的细胞毒性研究。MTT法检测其对Hep G2细胞活力的影响。3.细胞内外O₂水平的同时检测研究（1）分别检测正常人脐静脉内皮细胞（HUVECs）和Hep G2肿瘤细胞内外O₂浓度。同上,首先建立细胞内、外O₂浓度-EPR线宽标准曲线。采用终浓度20μM的CT-03 LPs分别与两种细胞孵育2小时后,洗去未进入细胞的CT-03 LPs,制备成密度为3×10⁷个/m L的细胞悬浮液,再分别加入CT02-H使其终浓度为50μM,待细胞悬浮液于空气中平衡5 min后,检测EPR线宽并计算O₂浓度。（2）检测Hep G2细胞内、外O₂消耗速率（Oxygen consumption rates,OCR）。Hep G2细胞随机分为3组:CT-03 LPs及CT02-H探针对照组、上述探针+线粒体呼吸链复合体Ⅰ抑制剂鱼藤酮组及上述探针+线粒体呼吸刺激剂甲萘醌组。探针对照组,按照上述方法制备装载CT-03 LPs的Hep G2细胞悬浮液,再加入CT02-H使其终浓度为50μM。探针+鱼藤酮组,同上加入上述两探针后,立即加入鱼藤酮至400μM。探针+甲萘醌组,同上加入上述两探针后,立即加入甲萘醌至10μM。各组处理结束后立即将样品转移至EPR毛细管并封闭管口两端,实时检测处理后立即至30 min内EPR线宽,并计算OCR。（3）采用台盼蓝染色法检测Hep G2细胞活力。结果:1.CT-03 LPs适用于Hep G2细胞内O₂检测（1）CT-03 LPs的性质表征。CT-03 LPs包封率为13.5±2.1%,平均粒径大小为167.5±2.4 nm,PDI为0.072±0.014,Zeta电位为27.8±0.8 m V。（2）温度、BSA及氧化还原物质对CT-03 LPs稳定性影响。CT-03 LPs粒径在室温放置第3天开始增大（P<0.05）;3天内Zeta电位无显著性变化;与初始浓度（100±0.11%）比较,放置3天其浓度百分比分别为95.13±2.45%（P>0.05）,85.55±1.62%（P<0.001）及75.27±3.77%（P<0.001）。在37℃下放置5个小时,CT-03和CT-03 LPs浓度均无显著性变化。500μM的BSA使CT-03的EPR线宽由210 m G增大到305 m G,对CT-03 LPs的EPR线宽无影响。H₂O₂、·OH、Asc、GSH、Fe²⁺、ROO·及O₂^·-使CT-03浓度显著降低（P<0.01,P<0.001）,以上各物质均未改变CT-03 LPs的浓度。（3）细胞内CT-03浓度随时间的变化。CT-03与Hep G2细胞孵育后未在细胞内检测到信号,相同条件下CT-03 LPs能进入Hep G2细胞内,并且细胞内CT-03LPs的浓度在共孵育的第3小时达到最大值,为24.35±2.37μM。（4）CT-03、CT-03LPs及细胞内CT-03 LPs的O₂敏感性分别为4.29、4.61及4.44 m G/%O₂,线性关系良好。（5）CT-03 LPs对Hep G2细胞存活率的影响。MTT结果显示,与对照组（100±1.93%）相比,CT-03 LPs浓度为10、15及20μM对Hep G2细胞存活率无显著性影响。25和30μM的CT-03 LPs会降低细胞存活率（P<0.01,P<0.001）。2.CT02-H适用于Hep G2细胞外O₂检测（1）孵育时间、FBS及氧化还原物质对CT02-H稳定性的影响。与CT02-H处理前（100±0.79%）比较,在37℃条件下温育1、3及5小时CT02-H溶液浓度分别为:96.17±1.98%（P>0.05）,93.51±1.75%（P<0.05）及86.96±2.13%（P<0.001）。10%FBS使其EPR线宽由231 m G增大到293 m G。GSH、O₂^·-及ROO·均使其浓度降低（P<0.001）,Asc、H₂O₂、Fe（II）-NTA络合物、Fe（III）-NTA络合物和·OH等物质均对其浓度无影响。（2）CT02-H的O₂敏感性为4.89 m G/%O₂,线性关系良好。（3）CT02-H对Hep G2细胞存活率的影响。MTT结果显示,与对照组（100±1.93%）相比,CT02-H孵育Hep G2细胞2小时后,不同浓度CT02-H的细胞存活率分别为:12.5μM（94.55±1.62%,P>0.05）、25μM（93.09±1.90%,P<0.05）、50μM（89.91±1.57%,P<0.01）及100μM（48.25±2.33%,P<0.001）。3.Hep G2细胞内外O₂浓度及OCR（1）常温常压下细胞内、外O₂浓度,HUVECs分别为173.2±2.6和203.1±4.3nmol/m L（P<0.01）;Hep G2分别为158.7±2.3和178.1±3.1 nmol/m L（P<0.01）。（2）Hep G2细胞内OCR为2.71±0.16 nmol/min/10⁷细胞,细胞外为2.21±0.04nmol/min/10⁷细胞（P<0.05）。与探针对照组比较,400μM鱼藤酮使细胞内、外OCR均显著降低（P<0.001）;10μM甲萘醌使其细胞内、外OCR均明显升高（P<0.001）。（3）台盼蓝结果显示,与加入探针前（100±0%）相比,CT-03 LPs、CT02-H双探针对细胞活力无显著影响,在探针基础上加入鱼藤酮、甲萘醌,细胞存活率分别下降为90.75±1.47%（P<0.01）和92.90±1.90%（P<0.05）。结论:1.采用薄膜分散法成功制备了CT-03 LPs,其稳定性高,细胞毒性低,能用于Hep G2细胞内O₂水平的定量检测。2.CT02-H稳定性好,细胞毒性低,能用于Hep G2细胞外O₂水平定量检测。3.CT-03 LPs和CT02-H分别作为细胞内、外O₂探针,能同步定量检测Hep G2细胞内、外的O₂浓度和OCR。