酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶(ACAT)是细胞内唯一合成胆固醇酯的酶,在细胞和生物体胆固醇代谢平衡中起着非常重要的作用.目前在哺乳动物细胞中发现两种基因编码ACAT(ACAT1和ACAT2).ACAT1广泛存在于各种组织细胞中,与细胞胆固醇代谢平衡有关；而ACAT2则选择性地在小肠和肝脏细胞中表达,主要参与饮食中胆固醇的吸收和载脂蛋白的装配.人类一些重要疾病如:涉及心脑血管病的动脉粥样硬化、神经系统的阿尔海默氏疾病及胆结石病等,都与ACAT密切相关.因此,ACAT已成为国际前沿密切关注的筛药靶标. ACAT是一种低含量的内质网膜蛋白,其天然型至今仍未成功纯化,所以在基因水平的研究是目前唯一有效的途径.1993年,美国Daitmouth医学院的TYChang教授实验室首先克隆得到了人ACAT1 cDNA K1,ACAT的分子生物学等研究才迅速发展起来．本论文工作所在的中国科学院上海生命科学研究院生物化与细胞生物学研究所李伯良教授实验室与美国TY Chang教授实验室合作研究，已首先报道了人ACAT1、ACAT2基因的基因组结构和它们的启动子序列等,而且在人ACATl基因的表达调控研究中取得很好进展.在这些研究基础上,本论文工作的主要部分是探索ACAT2基因分化、组织和种属特异性表达的分子机制. 首先，通过序列分析发现,在人ACAT2基因核心启动子区内,有4个肠细胞特异的转录因子Cdx2和1个在肝细胞及其它细胞中普遍表达的转录因子HNF1α的结合位点,并且第1、2个Cdx2(Cdx2-1和Cdx2-2)元件与HNF1α元件完全重叠.进而缺失突变、定点突变和启动子.荧光素酶报道基因活性分析结果都证明,它们是ACAT2基因肠细胞分化依赖启动子活性所必需.凝胶阻抑实验(EMSA)也证明,肠Caco-2细胞的核蛋白与ACAT2基因的启动子片段形成特异性结合条带,加入抗Cdx2或HNFla抗体后能形成超迁移,进一步证实了人ACAT2基因的启动子存在Cdx2和HNFlα式作用元件.进而,对Cdx2和HNFlα转录因子与ACAT2基因表达的关系进行详细的研究.利用未分化人肠细胞Caco-2以及小鼠成纤维NIH/3T3细胞(内源Cdx2、HNFlα和ACAT2的表达较低)进行野生型、突变型Cdx2和HNFlα基因共转染表达实验表明,野生型的Cdx2或HNFlα能提高人ACAT2基因启动子活性,而突变型的Cdx2或HNFlot没有效应.在分化的Caco-2细胞中,Cdx2或HNFlα表达的RNAi引起ACAT2基因表达的降低.利用肿瘤坏死因子(TNF-α)处理分化Caco-2细胞的实验揭示,TNF-α抑制Cdx2基因表达、但不影响HNFla表达,可同样引起ACAT2基因表达的相应降低,也表明Cdx2和HNFlα协同增强ACAT2基因启动子活性.深入的共转染表达实验和精细的EMSA结果显示,Cdx2和HNFlα的协同增强效应还依赖于Cdx2和HNFlα元件同时完整的存在.这些实验结果进一步肯定了转录因子Cdx2和HNFlα与顺式元件的结合,并且揭示了它们的相互作用对人ACAT2基因启动子的活性起关键作用.进一步的RT-PCR和Western blot的实验结果显示,在Caco-2细胞培养接触而分化的过程中,内源Cdx2、HNFlα和ACAT2的表达均随着细胞分化而增强； 利用丁酸钠(sodium butyrate,NaB)处理诱导Caco-2细胞分化时,证实了内源Cdx2、HNFlα、ACAT2表达具有肠细胞分化依赖性.同时,在未分化的Caco-2细胞中共转染表达外源性Cdx2和/或HNFlα,也非常显著地提高内源ACAT2基因的表达. 这些结果首次揭示,人ACAT2基因表达肠细胞分化依赖性的分子机制,即肠细胞分化依赖性表达的转录因子Cdx2、HNFlα协同增强人ACAT2基因启动子的转录活性.该分子机制的揭示,可有力地促进ACAT2基因表达的调控及其在胆固醇代谢平衡中生理功能和病理作用等方面的深入研究. 上述利用肠细胞研究人ACAl2基因表达的进展,为深入探索该基因在肝组织细胞中的表达奠定了很好的基础.我们在中山医院肝癌研究所的合作帮助下获得人肝组织、肝癌(HCC)及癌旁组织,结合多种人肝细胞株的研究表明,人肝细胞株、肝组织、肝癌(HCC)及癌旁组织均表达HNFlα；人正常肝细胞株LO2和肝组织中,均未观察到Cdx2和ACAq2的表达；而在肿瘤细胞株HepG2中,同时有Cdx2的表达,则也有ACAT2的表达；在50﹪的HCC病人(14例中的7例)中,其癌旁组织检测的结果与上述正常肝细胞株LO2、肝组织的一致,而癌组织检测的结果与上述肿瘤细胞株HepG2的一致,说明肝癌中ACAT2基因的表达与Cdx2的异位高表达密切相关.这些研究结果,不仅首次详细阐明了ACAT2基因肝细胞组织特异性表达的分子机制,而且提示ACAT2可作为检验肝癌的一种新的生物标记分子.文献报道的有关结果表明,ACAT2基因表达还具有种属特异性.在人胎肝中ACAT2高表达,而在成人肝则不表达或低表达；但在鼠肝中相反,在胚胎期ACAT2不表达或低表达,在成鼠期ACAT2高表达.我们在利用正常人肝组织、肝细胞LO2研究的基础上,深入利用成鼠肝组织、正常(AML12)和肿瘤(Hepal-6)肝细胞株的检测结果显示, Cdx2、HNF1α、ACAT2均相应地表达,这不仅肯定了ACAT2在成鼠肝中的高表达,而且表明鼠肝组织细胞中ACAT2的表达也可能与转录因子Cdx2、HNF1α的表达直接相关. 为探索ACAT2基因表达种属特异性的分子机制,我们首次克隆了小鼠的ACAT2基因启动子.序列分析表明,小鼠ACAT2基因启动子也有4个Cdx2和1个HNF1α结合位点,与人的不同在于Cdx2-2、Cdx2-3元件与HNF1α元件重叠.EMSA证实,小鼠ACAT2基因启动子可结合转录因子Cdx2和HNF1α共转染表达实验也证实,Cdx2、HNF1α不仅可增强小鼠ACAT2基因启动子的活性、而且也具有协同性作用,提示ACTA2基因的种属特异性表达很可能还有其它反式因子参与进行.同时,序列分析还显示,小鼠与人的ACAT2基因启动子序列只有约20﹪的同源性,仅在三小段序列区域有较高保守性,也表明非同源性的大部分序列则可能发挥种属特异性表达作用.进一步构建了一系列启动子.荧光素酶报告基因质粒,转染肝细胞表达结果显示,在人、鼠ACAT2基因启动子Cdx2、HNF1α元件的下游区域均存在转录活性抑制区,但其离转录起始位点的远近存在人、鼠间的显著差异.这些为深入探索人、鼠ACAT2基因启动子的结构(包括Cdx2、HNF1α元件和转录活性抑制区)差异与其种属特异性活性的关系等奠定了很好的基础. 本论文工作还有小部分是分析研究小鼠ACAT1 cDNA 5-IJTR.已有的结果揭示,人ACAT1 cDNA K1有一长1278 bp的5-UTR,由于这个非同寻常的5t-UTR,后来发现ACATl cDNA K1来源于两条染色体,其成熟的mRNA可能通过一种RNA分子间特殊的反式剪接加工而成.并且发现人ACAT1基因由18个外显子组成,外显子Xa和外显子1-16分别与人7号和1号染色体的相应序列一致,而微小外显子Xb(CCGAATrCGG)至今仍未在基因组上定位.比较人和小鼠ACAT1 cDNA序列得知,小鼠也有一长879 bp的5′-UTR,且序列中存在与人的Exon Xb相似的10 bp序列(AGGAATTCCG).为检测小鼠ACAT1cNDA 5′-UTR 是否也来源于两条不同的染色体,以文献报道的小鼠 ACAT1cDNA序列为基础,采用RT-PCR的方法,在小鼠的肠、肺、脾、睾丸组织和巨噬细胞RAW中进行检测,均没有得到跨越类似人外显子Xb序列的相应产物.进一步克隆并鉴定了小鼠ACAT1 cDNA5′-UTR,发现其中并不存在类似人外显子Xb的序列,即小鼠ACATl cDNA 5′-UTR与来源于两条不同染色体的人ACAn cDNA 5′-UTR不同.这将为深入探索人ACAT1 mRNA反式剪接发生机制提供基础. 综上所述,在本论文的上述两部分工作中,发现转录因子Cdx2、HNF1α能协同增强人ACAT2基因启动子的转录活性,首次揭示了人 ACAT2基因的肠细胞分化依赖性和组织特异性表达的分子机制；首次发现肠细胞特异转录因子Cdx2的异位表达引起人肝癌组织表达ACAT2,为肝癌早期诊断提供潜在的新生物标记分子；最先克隆小鼠ACAT2基因启动子,揭示人、鼠ACAT2基因启动子的转录活性抑制区；证实小鼠ACAT1 cDNA5′-UTR与来源于两条不同染色体的人ACAT1 cDNA5′-UTR不同.这些为深入研究阐明ACAT基因表达的调控及其在胆固醇代谢平衡中的生理功能和病理作用等提供了重要基础和研究线索.