【背景】细胞对于外界环境变化的应激过程是一个复杂的生物学过程。尽管相关性研究很多,但其分子机制以及细胞生理过程还不是很清楚。线粒体作为细胞内关键的细胞器,处于不断分裂与融合平衡之中,形态也随之而改变,但是其生理意义尚不清楚。线粒体融合、分裂作为一种保守的细胞生理过程,从植物、线虫、果蝇、大鼠、到人类都保持着线粒体动态的变化,所以推测其在生物体进化过程中,与机体适应外界环境的变化密切相关。寒冷作为一种机体外部环境变化因素,往往引起细胞内部发生复杂的变化,从而产生一定的应激反应。线粒体作为细胞能量代谢中心,其功能的调节对于细胞寒冷应激过程起到至关重要的作用。长时间及高强度寒冷应激会导致细胞产生损伤,其损伤可以是细胞坏死或是凋亡。温度冰点以下导致细胞内结晶,细胞膜破裂而引起细胞坏死;而在4℃环境中,细胞往往会出现凋亡现象。以往研究发现ROS增多往往是细胞损伤主要原因,同时伴随线粒体功能损害。Bcl-2家族作为细胞线粒体凋亡途径的执行者,可能参与了寒冷应激引起的细胞凋亡,但其分子机制不清。线粒体融合、分裂与细胞凋亡过程密切相关。线粒体分裂增多导致线粒体片段化,与细胞凋亡过程中线粒体形态相似,同时线粒体出现损伤,如线粒体膜电位降低,推测线粒体分裂很可能参与了线粒体途径介导的凋亡过程。而线粒体融合增多可以改善线粒体功能,对细胞可能起到一定的保护作用。线粒体功能正常与否关系到细胞低温环境中应激能力,所以线粒体融合、分裂很可能参与了细胞寒冷应激过程。【目的】研究冷应激对细胞的损伤作用,从线粒体融合、分裂角度探讨冷应激诱导细胞损伤的分子机制,阐明丙酮酸在细胞冷应激中的保护作用。【方法】(1)4℃环境培养建立HEK293细胞寒冷应激模型。(2)应用倒置显微镜、MTT方法、台盼蓝染色方法、Hoechst染色和流式细胞仪分析不同时间寒冷应激对细胞形态、生存活力以及凋亡的影响。(3)细胞免疫荧光方法观察Bax、Drp1和Mfn1细胞内定位。(4)用MitoTracker线粒体荧光探针标记线粒体,激光共聚焦显微镜观察线粒体的动态变化。(5)用RT-PCR、Western blot技术检测寒冷应激对细胞线粒体融合、分裂蛋白表达的影响。(6)用2,7-二氯氢化荧光素染色,流式细胞仪分析寒冷应激对细胞内ROS生成的影响。(7)通过荧光素-荧光素酶( luciferin–luciferase)的方法检测细胞内ATP的含量。(8)利用脂质体介导的基因转染法将构建的si-Mfn1和其空载体转染HEK293细胞,G418筛选获得稳定的克隆;脂质体介导的基因转染法将预先合成的si-Mfn2 RNA转染HEK293细胞。(9)利用罗丹明123荧光染料标记细胞,流式细胞仪分析细胞内线粒体膜电位(?Ψm)的变化。【结果】1.寒冷应激对细胞的损伤作用MTT结果显示寒冷应激2h、4h、8h和12h可引起细胞生存活力下降,12h降为最低;而寒冷应激4h表现为细胞活力相对2h增高。倒置显微镜检测结果表明寒冷应激2h和12h细胞形态出现明显皱缩及细胞漂浮现象。Hoechst染色结果显示,与对照组相比寒冷应激2h和8h细胞核出现致密浓染现象。流式细胞仪检测结果也显示寒冷应激2h、4h和8h细胞凋亡率分别为42.2%、33.6%和40.7%,提示寒冷应激可诱导细胞凋亡,而4h凋亡率低于2h。2.寒冷诱导的细胞凋亡可能通过线粒体途径实现寒冷应激后Bax表达水平无明显变化;Bcl-2表达水平先是增高,在4h达高峰,而后渐低。细胞免疫荧光检测结果显示,寒冷刺激后2h、8h出现Bax线粒体转位,2h寒冷刺激点出现细胞核皱缩及碎裂,线粒体出现片段化,提示线粒体在细胞寒冷应激损伤中起着重要作用。3.线粒体分裂、融合可能参与了细胞寒冷应激过程并且和ATP生成有一定关系激光共聚焦显微镜观察结果显示在寒冷应激过程中线粒体形态出现动态变化过程。应激2h,线粒体断裂增多;应激4h,断裂线粒体有一定程度的修复;应激10h,线粒体片段化又明显增多。透射电镜观察线粒体超微结构,发现寒冷应激4h线粒体为狭长、增大型,而8h线粒体变小、出现空泡化。线粒体融合蛋白Mfn1、Mfn2在寒冷应激4h显著增高,而线粒体分裂蛋白Drp1在寒冷应激4h显著降低,说明寒冷应激4h线粒体融合增多。而在寒冷应激2h,Drp1表达显著增高,Mfn1、Mfn2增高不明显,寒冷应激8h Drp1表达显著增高,Mfn1、Mfn2表达显著降低,提示寒冷应激2h、8h分裂增多。寒冷应激后细胞内ATP水平下降,2h、4h、8h和12h分别下降了46.4%、37.1%、64.0%和76.7%。4h ATP水平略高于2h水平,以上结果提示线粒体分裂增多ATP生成减少;融合增多时,ATP生成有一定增多。4.Mfn2蛋白在细胞寒冷应激过程可能起关键作用转染si-Mfn1细胞,寒冷刺激4h对细胞存活没有显著影响;而转染si-Mfn2细胞,寒冷刺激后细胞活力显著下降并出现死亡。抑制Mfn2表达,细胞寒冷应激4h后,Mfn1、Mfn2和Bcl-2显著降低,线粒体分裂蛋白Drp1表达增高,线粒体膜电位显著降低,ATP生成明显减少,细胞出现损伤,提示Mfn2蛋白在细胞寒冷应激过程可能起重要的作用。5.Drp1参与了寒冷应激细胞损伤,丙酮酸具有保护作用寒冷应激2h,线粒体分裂增多,Drp1出现线粒体转位,ATP生成减少,细胞发生凋亡。加入丙酮酸,可以部分逆转寒冷刺激2h引起的细胞损伤,增加细胞ATP水平,抑制Drp1线粒体转位,降低细胞凋亡率,对于细胞起到保护作用。【结论】1.寒冷应激导致细胞出现两个凋亡高峰,出现在寒冷应激2h和8h。而在寒冷应激4h细胞会出现一定适应反应。提示细胞自身可以对外界环境变化产生一定的应激能力。2.寒冷应激诱导细胞发生凋亡可能是通过线粒体途径调节的,线粒体功能损伤伴随细胞损伤过程,表现为细胞内ATP生成减少。3.线粒体融合、分裂过程参与了细胞寒冷应激过程,并且与线粒体功能密切相关。线粒体融合增多改善细胞线粒体功能,抑制细胞损伤发生,提示线粒体融合增多是细胞产生应激能力的分子机制。而线粒体分裂增多导致线粒体片段化,细胞出现损伤。提示线粒体过度分裂在细胞寒冷损伤中发生一定作用。4.初步证实了Mfn2蛋白在细胞寒冷应激过程可能起关键作用。5.丙酮酸可以增加线粒体ATP生成,抑制寒冷应激引起的Drp1线粒体转位及线粒体分裂增多,对于细胞寒冷应激损伤起一定的保护作用。