基质金属蛋白酶(MMPs)是锌离子依赖型金属蛋白酶种族中的蛋白水解酶亚族,能够调控多种细胞外基质(ECM)。由于MMPs催化结构域的活性中心口袋的疏水性氨基酸以及结合口袋的深浅不同,使其底物具有特异性。因此,结合口袋的长度与深度以及其周围与之结合的氨基酸对基质金属蛋白酶抑制剂(MMPIs)的设计和合成起到了重要的作用。在MMPs家族中,MMP-13在肿瘤等病理环境中被大量表达,且据报道,MMPs可以促进肿瘤细胞周围的新血管的生成。因此,研究MMPIs对于治疗肿瘤疾病具有着重要的意义。其中的催化结构域作为MMP-13发挥其生理功能的关键位点,成为设计研发MMP-13相关抑制剂的主要研究对象。本论文通过分子克隆、基因重组技术表达了易于纯化的MMP-13催化结构域(cdMMP-13),实现了对cdMMP-13的复性,并发现金属离子的引入不论对目标蛋白的浓度及纯度还是其二级结构的稳定性均有所影响,进而对不同价态金属离子的影响进行了筛选以及新型抑制剂抑制机理的研究。本文包括以下几方面内容:1.以pet-28a为载体的MMP-13催化结构域(cdMMP-13-pet28a)的制备及结晶条件的筛选诱导以pet-28a为载体的重组质粒的大肠杆菌BL21表达了 cdMMP-13,并对其采用动态吸附亲和色谱纯化方式进行纯化。获得纯度为95%的目标蛋白,质量为回收率65%。通过排阻色谱实现了 cdMMP-13的复性,并对其稳定性进行考察发现目标蛋白有轻微的降解现象。对复性后的蛋白进行结晶条件的筛选,共筛选384种条件,但无晶体生长。2.以pet-22b为载体的MMP-13催化结构域(cdMMP-13-pet22b)的制备通过分子克隆技术获得带有pet-22b为载体的重组质粒。对该质粒在BL21中的表达产物进行鉴定,结果表明cdMMP-13在BL21中可以表达,且以包涵体形式存在。对目标蛋白进行动态吸附纯化获得纯度为99%的目标蛋白,其质量回收率为80.2%,适用于制备药物筛选和结晶条件优化的蛋白样品。3.金属离子对cdMMP-13-pet22b的影响及其抑制剂机理的研究通过排阻色谱对cdMMP-13的复性,并在其中引入金属离子,发现可以得到更高浓度的蛋白,因此进一步通过圆二色谱(CD)对其结构进行研究,发现复性后的蛋白有二级结构,并且此结构域能够结合金属离子,这种结合能够导致蛋白结构的改变,增加结构域的稳定性。其中三价金属离子对其的稳定性影响最强,这有可能是由于三价金属离子替代了活性中心的锌离子,使得其与活性中心周围位点结合更为紧密。通过考察其存放的稳定性,发现目标蛋白在16℃和4℃均可稳定存放。利用荧光底物(Mca-Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg-NH2),通过动力学方法对复性后蛋白活性进行研究,结果证明通过对包涵体变复性的手段得到了有活性的目的蛋白。通过将不同价态的金属离子与阳性对照药(CL-82198)对cdMMP-13的抑制结果发现,半抑制浓度值(IC50)表明,三价金属离子对cdMMP-13均显示出较强的抑制作用。并且,相对于其他化合物,铁氰化钾(K3[Fe(CN)6])具有最好的抑制效果,其IC50为1.3μM。通过ITC实验和细胞成管实验研究发现K3[Fe(CN)6]与蛋白有结合,并能抑制肿瘤细胞周围血管的生成,说明K3[Fe(CN)6]是MMP-13的一个有效的活性抑制剂。通过对结晶时cdMMP-13蛋白浓度、沉淀剂硫酸铵浓度、结晶温度等条件进行筛选,最终确定cdMMP-13蛋白晶体生长最好条件为cdMMP-13蛋白浓度18mg/ml,硫酸铵浓度为1.8mol/L,温度16℃,此晶体用于后续X-Ray衍射。