迄今,作为一种常见的消化道恶性肿瘤,食管癌发生发展的分子机制在许多方面依然不甚清楚。Desmocollin 2(DSC2)是桥粒胶糖蛋白家族的成员之一,在正常上皮细胞间的粘附中发挥重要作用。有研究报道,DSC2在结直肠癌等肿瘤组织中表达下降,推测会直接破坏细胞间的桥粒连接,有损组织结构与功能的完整性。关于食管癌中DSC2的表达、功能及其分子调控机制,至今未见研究报道。本课题组在前期实验中发现,在食管癌细胞,敲降Fascin基因表达,伴随着癌细胞的移动侵袭能力减弱与粘附能力增强,DSC2的表达显著上调。提示DSC2在食管癌的发生发展中可能扮演着某种重要角色。因此,有必要把该基因在食管癌中的表达、功能及其分子调控机制等重要科学问题研究清楚。基于此,在本论文中,我们通过综合运用组织芯片、免疫组化、免疫荧光、Western blotting、RT-PCR、RNA干扰和真核基因表达等系列实验技术手段,就上述科学问题展开深入研究,结果详见下述。首先,通过RT-PCR、免疫组化、免疫印迹等实验技术,检测DSC2以及桥粒钙粘素家族其它成员在食管癌组织中的表达情况。结果发现,①与配对的正常食管上皮组织相比,在食管癌组织中,DSC2 mRNA表达明显下调,而DSC3 mRNA表达无显著差异;对DSC1,无论食管癌组织,还是正常食管上皮组织,表达水平均很低。②与配对的正常食管上皮组织相比,在食管癌组织中,DSC2蛋白表达水平也显著下调,并表现出由胞膜异位到胞浆的特点。统计分析结果显示,DSC2蛋白表达,与食管癌组织分化显著正相关(P <0.05),与临床分期显著负相关(P <0.05),与食管癌患者的生存期显著正相关。提示DSC2表达下调可能在食管癌的发生发展中发挥着某种重要作用,检测DSC2表达可以警示食管癌患者的预后。其次,通过正反两种实验策略,探讨了DSC2对食管癌细胞的分裂增殖与移动能力的影响。①实时定量RT-PCR和细胞免疫荧光染色实验结果表明,不同的食管癌细胞系DSC2的表达水平存在差异,SHEEC等食管癌细胞表达DSC2的水平较高,EC109和KYSE150等食管癌细胞表达DSC2的水平相对较低,因此,为后续研究DSC2功能,提供了良好的对比细胞模型。②在EC109和KYSE150细胞,通过基因转染建立稳定高表达DSC2食管癌细胞株。分裂增殖与移动能力检测实验结果表明,与转染空载体的对照细胞相比,DSC2高表达的KYSE150细胞的移动能力显著降低,但分裂增殖能力未见明显变化;而DSC2高表达的EC109细胞的移动能力有所降低,但差异不显著,分裂增殖能力也无明显变化。提示DSC2在食管癌细胞移动等行为中发挥作用可能还受其它因素的影响制约。③通过人工合成的siRNA瞬时转染SHEEC细胞。检测实验结果表明,伴随着DSC2表达下调,细胞的移动能力显著增强。因此,从多个不同角度为DSC2下调表达促进食管癌细胞移动提供了确切实验证据。再次,为研究探讨DSC2下调表达促进食管癌细胞移动的分子机制,分别以DSC2基因稳定过表达和RNA干扰敲降DSC2表达的食管癌细胞为模型,通过免疫细胞化学和免疫印迹等实验方法,对细胞中β-catenin蛋白的定位和表达水平进行检测。结果发现,①与对照细胞比较,KYSE150细胞过表达DSC2后,在细胞总β-catenin蛋白无明显变化的情况下,细胞核中的β-catenin蛋白明显下调;②敲降DSC2表达能够显著促进β-catenin蛋白的细胞核聚集;③TOPflash荧光素酶活性实验分析证实,KYSE150细胞高表达DSC2后,TOPflash荧光素酶的活性受到明显抑制。④至于EC109细胞,由于β-catenin/TCF途径未被激活,因此,虽然高表达DSC2,但细胞的移动和黏附能力并未发生相应显著变化。上述诸实验结果一致说明,食管癌中,DSC2的下调表达可能会引发β-catenin蛋白从浆到核的移位,激活β-catenin/TCF途径,上调某些细胞移动相关基因表达,促进食管癌细胞的移动。最后,为了弄清楚DSC2的下调表达究竟受哪些因素控制,本论文又从食管癌细胞中分别克隆了DSC2基因的5′端转录调控区启动子序列和3′端非翻译区(3′Untranslation Region, 3′UTR)序列。5′端转录调控区启动子序列分析发现,该区域富含CG二联核苷酸,提示可能存在CpG岛,即在食管癌组织细胞中,有在表观遗传学层面调控DSC2表达的可能性。然而,亚硫酸氢盐修饰基因组测序结果表明,无论是DSC2低表达的食管癌细胞,还是DSC2高表达的食管癌细胞,在DSC2基因启动子区均未见高甲基化修饰CpG位点呈现。这说明食管癌细胞中,DSC2的下调表达是一种非甲基化调控机制。而针对DSC2基因3′UTR的miRNA预测结果显示,DSC2基因3′UTR上存在着多个潜在的miRNA保守结合位点。而报告基因荧光素酶活性检测结果证实,食管癌细胞中可能的确存在着某种miRNA,结合DSC2基因3′UTR,调控报告基因荧光素酶活性,而且该miRNAs很可能包括miR-25。为确认上述结果,我们选取KYSE150(DSC2低表达,miR-25高表达)和SHEEC细胞(DSC2高表达,miR-25低表达)给予进一步验证。报告基因荧光素酶活性检测结果显示,转染miR-25可明显下调DSC2报告基因荧光素酶活性,转染miR-25抑制剂可明显上调DSC2报告基因荧光素酶活性;而当把DSC2基因3′UTR上的miR-25结合位点突变后,则上述调控效应消失。另外,免疫荧光检测实验结果表明,食管癌细胞转染miR-25或miR-25抑制剂,在DSC2蛋白表达本身,亦呈现相应变化。这些结果一致说明,miR-25能够与DSC2基因3′UTR结合,是在转录后水平调控DSC2表达的重要因子。另外,为了进一步确认miR-25可能经由调控DSC2等靶基因表达,进而影响食管癌细胞的肿瘤生物学行为,本论文又对miR-25在食管癌中的表达及其功能进行了深入检测分析。定量PCR检测结果显示,与配对的正常食管上皮组织相比,在食管癌组织中miR-25明显上调表达,且与食管癌临床分期呈显著正相关关系(P<0.05)。而与此同时还研究发现,直接转染miR-25,还能够显著增强食管癌细胞的移动能力。综上,本论文的系列实验结果说明,1)DSC2在食管癌中显著下调表达,与患者的预后相关;2)DSC2的下调表达可引发食管癌细胞β-catenin蛋白从胞浆到胞核的移位,激活β-catenin/TCF途径,促进癌细胞向更恶的方向发展;3)miR-25能够与DSC2基因3′UTR结合,在转录后水平,调控DSC2表达;4)miR-25在食管癌中显著异常过表达,可能通过下调DSC2等靶基因表达,促进食管癌细胞移动。