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目的:构建携带人源化的绿色荧光蛋白(hrGFP,humanizedgreen fluorescentprotein)膀胱癌组织特异性报告基因腺病毒载体Ad5-PSCAE-UPII-E1A-IRES-hrGFP,为检测膀胱癌循环肿瘤细胞提供了一种新的检测方法。方法:根据图谱选取BglII和PmeI两种限制性内切酶分别对pShuttle-CMV-IRES-hrGFP和pShuttle-PSCAE-UPII-E1A进行分步酶切,pShuttle-CMV-IRES-hrGFP酶切后获得IRES-hrGFP目的片段,pShuttle-PSCAE-UPII-E1A酶切后获得PSCAE-UPII-E1A目的片段,对IRES-hrGFP目的片段和PSCAE-UPII-E1A目的片段进行胶回收。将回收得的两个片段IRES-hrGFP目的片段和PSCAE-UPII-E1A目的片段使用T4连接酶连接,16°恒温箱过夜,连接液转化至DH5α感受态细胞中、涂板,16小时后选取阳性克隆,过夜摇菌,用菌液聚合酶链反应(PCR)、基因测序(IRES-hr GFP片段)鉴定新构建的穿梭质粒pShuttle-PSCAE-UPII-E1A-IRES-hrGFP。将pShuttle-PSCAE-UPII-E1A-IRES-hr GFP用酶PmeI线性化后,电击法转化到含pAdEasy的BJ5183感受态细胞,转化、涂板后选取阳性克隆,过夜摇菌,重组后的质粒Ad-PSCAE-UPII-E1A-IRES-hrGFP经过酶切(PacI、BsphI)、菌液PCR鉴定正确后,通过脂质体lipfectamine2000转染至包装细胞HEK293,包装成膀胱癌组织特异性报告基因腺病毒Ad5-PSCAE-UPII-E1A-IRES-hrGFP。结果:pShuttle-CMV-IRES-hrGFP和pShuttle-PSCAE-UPII-E1A经过BglII和PmeI酶切后胶回收目的片段,将两个目的片段用T4连接酶连接,形成新的穿梭质粒pShuttle-PSCAE-UPII-E1A-IRES-hrGFP,新构建的穿梭质粒pShuttle-PSCAEUPII-E1 A-IRES-hrGFP经PCR鉴定和IRES-hr GFP基因测序鉴定,成功后利用细菌内同源重组法制备出组织特异性膀胱癌的腺病毒载体pAd-PSCAE-UPII-E1A-IRES-hrGFP,经酶切和PCR鉴定后,通过脂质体转染至HEK293,荧光显微镜观察到hrGFP基因的表达,包装成报告基因腺病毒Ad5-PSCAE-UPII-E1A-IRES-hrGFP,经四轮扩增纯化后,测得病毒滴度为1.87×1011pfu/ml。结论:利用酶切从两个穿梭质粒中相应的获取所需的片段,通过连接反应形成新的pShuttle-PSCAE-UPII-E1A-IRES-hrGFP。细菌内同源重组法成功构建出pAd5-PSCAE-UPII-E1A-IRES-hrGFP重组腺病毒质粒。制备出的报告基因重组腺病毒为检测膀胱癌循环肿瘤细胞奠定了基础。