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胸腺肽是胸腺分泌的一种小分子多肽,根据等电点的不同分为α(pI<5.0)、β(5.0<pI<7.0)和γ(pI>7.0)三个家族,每一族成员按其发现的先后顺序注以相应下标。本课题的研究对象是β类胸腺肽中的第四个成员,因此,命名为胸腺肽β4(Thymosinβ4,Tβ4)。早期的研究表明Tβ4是一种球形肌动蛋白(G-actin)结合肽,能与G-actin单体结合阻断其聚合。随着研究的深入,Tβ4的其他生物学功能相继被发现,如促进血管生成,创伤愈合,角膜修复和抑制炎症以及调控肿瘤转移等,这预示着Tβ4可能是一种多功能药物。Tβ4潜在的临床应用吸引了众多国内外研究者和制药企业的兴趣,这其中美国的雷根内克斯(RegeneRx)制药有限公司已经率先合成出了Tβ4并正在进行临床试验,而国内的一些研究机构和研究小组也在尝试通过生物手段制备Tβ4。一直以来Tβ4的制备都是以动物胸腺提取和化学合成为主,但这两种方法都存在先天不足,动物胸腺提取的Tβ4来源有限,成本高昂,成分不够确切,且免疫原性较高;而化学合成虽说在成分和免疫原性方面有了很大改进,但同样高昂的成本限制了产品的推广和使用。因此,价廉质优的生物制备法成为了首选,但这也并非唾手可得的易事,Tβ4是一个43个氨基酸残基组成的N端乙酰化的小分子多肽,其表达和乙酰化都是生物制备无法回避的困难。本文的目的是要利用基因工程技术制备Tβ4,从而在现有的动物胸腺提取和化学合成外开辟一条新的低成本、低免疫原性、成分更确切的生物制备途径。为了获得Tβ4这种小分子多肽的高表达,本文设计在大肠杆菌表达系统内对其进行融合表达,同时将一种N端乙酰化转移酶与Tβ4融合蛋白共表达,利用该酶在胞内实现Tβ4的N端乙酰化修饰,再进行融合蛋白的切割,释放天然Tβ4。我们设计了两种融合方案,一种是在Tβ4的C末端融合大肠杆菌核糖体亚基蛋白L12,并在两者之间增加一个半胱氨酸残基(Cys),构建了融合蛋白Tβ4-Cys-L12,简称B2。首先,我们利用重叠PCR扩增了B2的编码基因,克隆进pET-22b载体,构建了B2的表达载体pET-B2。然后,我们将N端乙酰化转移酶NAT的基因nat克隆进pET-22b的兼容性质粒pACYCDuet-1中,构建了NAT的表达载体pACYC-nat。将上述两种重组质粒共同转化进BL21(DE3)中诱导表达,获得了N端乙酰化的B2融合蛋白。B2中添加的Cys残基形成了一个特异性化学切割位点,用1-Cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate(CDAP)介导的化学法在该残基处切除融合伴体得到Tβ4;另一种是在Tβ4的C端融合内含肽(intein),形成Tβ4-intein融合蛋白。我们首先将intein基因克隆进pET-22b载体中,构建重组质粒pET-intein,再通过PCR扩增Tβ4基因tb4,将之克隆进pET-intein载体中,构建了融合蛋白表达载体pET-tb4-intein,并与上述的乙酰转移酶表达载体pACYC-nat共转BL21(DE3),诱导表达获得N端乙酰化的Tβ4-intein融合蛋白。然后利用intein的N端切割能力,在外源DTT诱导下玩完成切割,释放出Tβ4。我们选择了3种intein:Ssp/Mxe/Spl用于融合,并在三个融合蛋白中筛选出了切割活性最高的一个,研究其切割百分比随时间的变化,制作出切割动力学曲线。为了便于后续对产物Tβ4进行PEG化修饰,我们还对Tβ4进行了修饰,在其C端添加了一个Cys残基,并与上述三种intein融合,形成Tβ4+C-intein融合蛋白。我们进行了融合蛋白的切割实验,考察intein对修饰后融合蛋白的切割行为,并与Tβ4-intein进行了比较。实验结果表明B2和Tβ4-intein两类融合蛋白在大肠杆菌表达系统内都得到稳定高效的表达,质谱分子量鉴定和N端测序表明其N端都得到了较好的乙酰化。CDAP化学切割法能够在短时间内完成B2的切割,得到的产物经质谱分析与天然Tβ4一致,但切割率不高,只有约66%。3种Tβ4-intein融合蛋白经筛选发现Tβ4-Spl的切割效率最高,在0.2 M DTT诱导下,37℃作用24 h约80%前体蛋白完成了切割,得到的Tβ4经质谱鉴定也与天然Tβ4并无二致。3种Tβ4+C-intein表达过程存在不同程度的体内切割,选择相对稳定的Tβ4+C-Spl进行研究,发现其切割反应趋势与Tβ4-Spl类似,且在反应的前12 h Tβ4+C-Spl比Tβ4-Spl切割效率更高,50%融合蛋白发生切割的时间(T1/2)也更短,前者T1/2为5.5 h,T1/2为7.3 h。通过本课题的研究我们可以得出结论:小分子Tβ4通过基因融合可以实现大量稳定表达,通过共表达N端乙酰转移酶可以在大肠杆菌表达系统内实现蛋白的乙酰化修饰,利用CDAP化学法和intein法都能切割融合蛋白,但intein切割方法优于CDAP法,最终我们通过融合表达和intein切割实现了Tβ4的生物制备。