放射治疗是宫颈癌临床治疗的重要手段。临床资料显示,IA期宫颈癌患者放疗后5年生存率可达90%以上。然而,宫颈癌的临床放射治疗仍存在一个主要问题:放疗后出现的复发转移。值得关注的是,电离辐射在治疗肿瘤的同时也可以促进肿瘤细胞的侵袭转移潜能。因此,加深理解电离辐射对肿瘤侵袭转移的调节作用及其机制具有十分重要的意义。肿瘤侵袭转移是一个复杂而有序的生物过程,涉及细胞内多种信号通路,这些信号通路得以有序进行,依赖于重要调控因子参与的众多细胞学事件的发生。其中肿瘤细胞出现上皮间质转化是肿瘤浸润转移的重要细胞学基础。本科室前期研究发现,2Gy ⁶⁰Coγ射线辐照促进直肠癌、乳腺癌和肺癌等多种肿瘤细胞发生EMT^[1]。既往也有研究证实,辐射可以通过诱导多种转录因子如HIF-1、Snail、ZEB1及TGF-β促进肿瘤细胞EMT的发生。近年来微小RNA（microRNA,miRNA）作为基因表达、转录及调控的重要因子,在肿瘤的发生发展中起着举足轻重的作用。MicroRNA参与了许多与肿瘤辐射应激反应相关的细胞调控过程,包括DNA损伤反应和修复、细胞凋亡、增殖和血管生成等。课题组前期研究发现,miR-1290在辐射抗性宫颈癌细胞中的表达明显升高^[2]。因此,本研究旨在明确miR-1290是否参与宫颈癌细胞侵袭转移能力的调控。我们根据临床宫颈癌的放射治疗方式,模拟其分割疗法,建立具有辐射抗性的宫颈癌HeLa细胞株。利用慢病毒载体调变miR-1290在宫颈癌HeLa细胞中的表达。随后通过离体细胞实验明确miR-1290诱导宫颈癌HeLa细胞发生EMT。采用蛋白印迹实验、双荧光素酶报告基因实验初步解析miR-1290的靶基因。本研究从microRNA角度,探寻宫颈癌放疗后复发转移的作用与机制,以期寻找miR-1290与宫颈癌放疗后复发转移的关系,为宫颈癌的放射治疗提供新的辅助治疗方式,减少放疗后远处转移的发生。研究目的:1.明确辐射是否诱导HeLa细胞中miR-1290的表达。2.证实miR-1290对HeLa细胞上皮间质转化的调控作用。3.探究miR-1290对HeLa细胞上皮间质转化调控作用的分子机制。研究方法:1.HeLa细胞分别经不同剂量的⁶⁰Coγ射线照射,采用实时定量聚合酶链式反应（quantitative real time polymerase chain reaction,qRT-PCR）检测辐照后不同时间点HeLa细胞中miR-1290的表达。2.采用2Gy ⁶⁰Coγ射线连续照射HeLa细胞,建立具有辐射抗性的HeLa细胞株。采用平板克隆实验鉴定辐射抗性的HeLa细胞株。通过qRT-PCR比较辐射抗性细胞与亲本HeLa细胞中miR-1290的差异表达。3.制备miR-1290的慢病毒表达载体并感染HeLa细胞,利用嘌呤霉素筛选并通过实时定量PCR鉴定稳定调变miR-1290表达的HeLa细胞株。4.通过显微镜观察稳定调变miR-1290表达的HeLa细胞株的形态学变化。5.采用Western blot和免疫荧光染色,以稳定调变miR-1290表达的HeLa细胞株作为研究模型,检测上皮标志物E-cadherin和间质标志物N-cadherin的表达。6.通过皮下注射稳定调变miR-1290表达的HeLa细胞株及其亲本细胞,建立裸鼠移植瘤模型。手术切除瘤体并制成石蜡切片,通过免疫组织化学染色,检测上皮标志物E-cadherin和间质标志物N-cadherin的表达。7.以稳定调变miR-1290表达的HeLa细胞株作为研究模型,借助划痕实验和Transwell侵袭实验,观察HeLa细胞中miR-1290调变对转移和侵袭能力的作用。8.通过在线生物信息学软件同时结合候选靶基因的功能,进行miR-1290靶基因的预测,并借助双荧光素酶报告基因实验进行验证。9.以稳定调变miR-1290表达的HeLa细胞株作为研究模型,采用Western blot和免疫荧光染色,检测Smad4和GSK-3β的表达。10.利用免疫组织化学染色,在上述（研究方法6）裸鼠移植瘤石蜡切片中,检测Smad4和GSK-3β的表达。11.借助DNA重组技术,将Smad4-siRNA或GSK-3β-siRNA瞬时转染入HeLa细胞,通过Western blot检测E-cadherin和N-cadherin的表达。实验结果:1.将HeLa细胞经不同剂量⁶⁰Coγ射线单次照射后,qRT-PCR结果提示,照射后4h、8h、12h、24h和48h,HeLa细胞中miR-1290的表达上调。通过连续11次⁶⁰Coγ射线照射HeLa细胞,获得细胞株HeLa-R11。平板克隆实验结果显示,与HeLa细胞相比,HeLa-R11克隆形成能力明显增强,提示成功构建辐射抗性HeLa细胞株。qRT-PCR结果显示,HeLa-R11中miR-1290的表达明显上调。上述实验结果证明,单次或多次⁶⁰Coγ射线辐照可诱导HeLa细胞中miR-1290表达。2.qRT-PCR证实成功构建稳定调变miR-1290表达的HeLa细胞株（HeLa-virus-control、HeLa-miR-1290和HeLa-miR-1290-inhibition）。显微镜下观察发现,HeLa-miR-1290细胞呈现出明显的间质细胞样外观,表现为胞间隙增宽、细胞尾足拉长、细胞极性消失出现梭形细胞形态。3.Western blot结果显示,上调HeLa细胞中miR-1290的表达,可降低E-cadherin的表达,同时增高N-cadherin的表达。裸鼠移植瘤石蜡切片免疫组织化学染色结果显示,miR-1290的表达与间质标志物N-cadherin的表达呈正相关,与上皮标志物E-cadherin的表达呈负相关。4.划痕实验结果证明,上调miR-1290的表达可增加HeLa细胞的迁移能力,下调miR-1290的表达可降低细胞的迁移能力;Transwell侵袭实验结果证明,上调miR-1290的表达可增加HeLa细胞的侵袭能力,下调miR-1290的表达可降低细胞的侵袭能力。5.在线数据库分析及双荧光素酶报告基因实验证实SMAD4和GSK3B是miR-1290的靶基因。6.Western blot结果显示:上调HeLa细胞中miR-1290的表达,可降低Smad4和GSK-3β的表达。裸鼠移植瘤石蜡切片免疫组织化学染色结果显示,miR-1290的表达与Smad4和GSK-3β的表达呈负相关。此结果提示,miR-1290可抑制Smad4和GSK-3β的表达。7.Western blot结果显示,下调HeLa细胞中Smad4的表达,可降低E-cadherin的表达,同时升高N-cadherin的表达;下调HeLa细胞中GSK-3β的表达,可升高N-cadherin的表达。此结果表明,Smad4和GSK-3β可抑制HeLa细胞上皮间质转化的发生。结论:1.辐射可上调miR-1290在宫颈癌HeLa细胞中的表达。2.miR-1290促进宫颈癌HeLa细胞发生上皮间质转化。3.SMAD4和GSK3B是miR-1290的靶基因。4.miR-1290调控的Smad4和GSK-3β参与了辐射诱导的HeLa细胞上皮间质转化的发生。