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目的及意义近年来我国恶性淋巴瘤的新发率呈逐年上升趋势,其上升速度超过其他恶性肿瘤而高居首位,严重威胁着我国人民的身体健康。前体T淋系肿瘤即T淋巴母细胞性急性白血病/淋巴瘤(T-cell acute lymphoblastic leukemia/lymphoblastic lymphoma, T-ALL/LBL)在恶性淋巴瘤疾病中占有一定比例,其恶性程度高,侵袭性强,进展速度快,目前已有的放疗、化疗、造血干细胞移植等治疗方法尚不能取得令人满意的效果,探索新的有效的治疗前体T淋系肿瘤的方法是一项亟待解决的医学任务。作为新兴的从分子水平解决疾病问题的治疗手段,基因治疗极有希望成为继手术、放疗、化疗之后新一代更为有效的肿瘤治疗手段。FS7相关细胞表面抗原(FS7-associated cell surface antigen, Fas)是启动细胞外部凋亡途径的重要的细胞表面死亡受体(death receptor, DR)之一,其介导的凋亡通路是T淋巴细胞在正常生理状态下进行凋亡的主要途径,在维持T淋巴细胞数量稳定方面发挥着重要作用,研究发现Fas缺陷参与多种良性及恶性T淋巴细胞增殖类疾病的发生发展过程。基于以上事实,我们就基因转染上调Fas表达对T淋系肿瘤细胞体外凋亡以及体内肿瘤形成的影响进行了相关研究,试图探索一种新的有效的用于前体T淋系肿瘤的基因治疗方法。方法扩增目的基因:在本人知情同意情况下,采集一名健康志愿者外周抗凝血5ml,经密度梯度离心法从中分离得到单个核细胞,应用Trizol试剂将单个核细胞充分裂解后经氯仿、异丙醇等处理提取总RNA,将总RNA经逆转录酶等作用后逆转为总cDNA,应用相应引物经PCR技术扩增得到包含kozak及全部外显子在内的正常人Fas基因序列,将PCR产物进行凝胶电泳、割胶回收并纯化得到目的基因。构建真核表达载体:将目的基因装入pMD-18T载体转化至感受态细胞DH5α,进行扩增克隆后提取质粒,应用相应引物经PCR从该质粒扩增目的基因Fas,经内切酶及连接酶将其装载至真核表达载体质粒pCDNA3.1(+),构建pCDNA3.1(+)-Fas质粒,对其进行测序,将结果与Genbank M67454序列进行对比。稳定转染细胞:将真核表达质粒pCDNA3.1(+)-Fas转染至人急性T淋巴细胞白血病(T-cell acute lymphoblastic leukemia, T-ALL)细胞株Jurkat细胞内,应用含500mg/L浓度G418的培养液进行筛选,筛选后存活细胞继续用含250mg/L浓度G418的培养液进行培养传代,建立稳定转染有正常人Fas基因的Jurkat-Fas细胞株。检测Jurkat细胞和Jurkat-Fas细胞中Fas基因表达水平差别:分别提取两种细胞的总RNA,经逆转录合成总cDNA,应用相应引物经PCR分别扩增两细胞株的目的基因Fas及看家基因GAPDH,将PCR产物进行凝胶电泳后在紫外光下成像,依据DNA标记定性判断两细胞株中Fas基因表达情况;应用针对Fas基因和GAPDH基因的相应引物分别将两细胞株进行定量PCR检测,定量判断两细胞株中以GAPDH基因为基准的Fas基因的相对定量表达情况,重复实验操作三次,结果以均数±标准误形式表示。检测Jurkat细胞和Jurkat-Fas细胞中Fas蛋白表达水平差别:应用PE标记的抗人Fas抗体分别对两种细胞进行避光染色,PBS液洗涤后在488nm波长光下应用共聚焦显微镜观察细胞Fas蛋白表达情况;分别应用PE标记的抗人Fas抗体和PE标记的鼠IgG1κ对两种细胞进行避光染色,PBS液洗涤后应用流式细胞仪检测荧光强度,定量判断两细胞株中以鼠IgG1κ同型对照为基准的Fas蛋白的相对定量表达情况,重复实验操作三次,结果以均数±标准误形式表示。检测Jurkat细胞和Jurkat-Fas细胞体外凋亡敏感性的差别:应用含人可溶性Fas配体(Fas ligand, FasL)25ng/ml的培养液处理两种细胞,分别收集处理0小时、12小时、24小时三个时间点的两种细胞,应用Alexa Fluor○R488 annexin V和碘化丙啶(propidium iodide, PI)避光染色,PBS液洗涤后应用流式细胞仪检测凋亡率,重复实验操作三次,结果以均数±标准误形式表示。检测Jurkat细胞和Jurkat-Fas细胞在裸鼠体内形成肿瘤的差别:将8只4周龄BALB/c雄性裸鼠经全身亚致死剂量射线照射后平均随机分为两组,分别在裸鼠左上肢腋窝处皮下注射5×107的Jurkat细胞和Jurkat-Fas细胞,自注射细胞后7天始,所有裸鼠每7天通过尾静脉注射人可溶性FasL一次,每4天测量一次肿瘤大小,观察肿瘤生长情况40天。统计两组裸鼠肿瘤生长大小,结果以均数±标准误形式表示。结果成功构建含目的基因的真核表达质粒:真核表达质粒pCDNA3.1(+)-Fas中针对Fas基因的测序结果经对比与Genbank M67454序列完全一致,标志目的基因正常人Fas基因被成功克隆。Jurkat-Fas细胞内Fas mRNA水平较Jurkat细胞内Fas mRNA水平明显增高:两细胞株中Fas mRNA经RT-PCR扩增凝胶电泳成像示,200-300bp区域内均可见GAPDH基因的清晰条带,而在1000-1500bp区域内,Jurkat-Fas细胞处可见Fas基因的清晰条带,而Jurkat细胞处未能见到明显的Fas基因清晰条带;两细胞株中Fas mRNA经实时定量PCR检测结果示Jurkat-Fas细胞的Fas mRNA水平明显高于Jurkat细胞的Fas mRNA水平,P=0.0007,前者大约是后者的二倍。Jurkat-Fas细胞内Fas蛋白水平较Jurkat细胞内Fas mRNA水平明显增高:两细胞株细胞表面Fas蛋白经共聚焦显微镜观察图像示Fas蛋白表达于细胞表面,Jurkat-Fas细胞表面的Fas蛋白较Jurkat增多;Jurkat和Jurkat-Fas细胞表面Fas蛋白经流式检测结果示Jurkat-Fas细胞的Fas蛋白明显高于Jurkat细胞的Fas蛋白水平,P<0.0001,前者大约是后者的二倍。FasL处理下Jurkat-Fas细胞凋亡率较Jurkat细胞凋亡率明显增高:FasL处理12小时,Jurkat-Fas细胞的凋亡率大约是Jurkat细胞凋亡率的3倍,前者较后者明显增高,P=0.0012;FasL处理24小时, Jurkat-Fas细胞的凋亡率大约是Jurkat细胞凋亡率的4倍,前者较后者明显增高,P<0.0001。FasL处理下Jurkat-Fas细胞体内肿瘤形成能力较Jurkat细胞体内肿瘤形成能力明显降低:在FasL处理下,24天后接种Jurkat细胞的4只裸鼠开始在注射部位出现肿瘤并稳定生长,而另外接种Jurkat-Fas细胞的4只裸鼠在观察期内无一出现肿瘤生长。过表达Fas明显抑制了前体T淋系肿瘤在体内的生长,第24天时间点上,P=0.0048;第28天时间点上,P=0.0022;第32天时间点上,P<0.0001;第36天时间点上,P=0.0002;第40天时间点上,P=0.0004。结论在本研究中,我们通过向人急性T淋巴细胞白血病细胞株Jurkat稳定转染正常人Fas基因建立了一株过表达Fas的细胞Jurkat-Fas,两细胞间的比较证明Fas蛋白的表达与Fas mRNA水平呈平行关系。在可溶性人FasL处理下,Jurkat-Fas细胞的体外凋亡率较Jurkat细胞明显增高,其凋亡敏感性与Fas mRNA水平、Fas蛋白水平呈平行关系。在可溶性人FasL处理下,Jurkat-Fas细胞在裸鼠体内的肿瘤形成能力较Jurkat细胞明显减低,其肿瘤生长能力与Fas mRNA水平、Fas蛋白水平呈负相关关系。由此可见,通过Fas基因转染上调Fas蛋白表达有可能成为一种新的有效的治疗前体T淋系肿瘤的基因治疗方法,要实现该方法在临床上的运用,还需要进一步研究如何避免Fas介导的细胞增殖作用、Fas凋亡通路中调节蛋白对该通路的影响以及Fas转染的靶向性等相关问题。