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研究背景:三氧化二砷(As2O3)是目前治疗急性早幼粒细胞白血病(Acute Promyelocytic Leukemia;APL)的有效药物之一,它通过靶向降解APL的肿瘤特异性致病癌蛋白即PML-RARα融合蛋白达到治疗的目的。进一步的研究显示,As203的作用位点是PML-RARα融合癌蛋白的PML部分,同时As2O3也可以作用于正常的PML蛋白(Promyelocytic Leukemia),诱导其多聚化并招募其它蛋白,发生SUMO化和泛素化,最终通过泛素-蛋白酶体途径降解。PML蛋白通常参与构建PML核小体(PML-NBs),从而对细胞内的生理功能起到调控作用。目前已知PML蛋白有七种亚型,它们具有相同的N端和不同的C端。PML蛋白除了持有相同的功能外,各亚型特有的C端还赋予其不同的生物学特性。新英格兰医学杂志报道,等位基因PML上发生突变也可以导致As203耐药现象,表明PML蛋白对PML-RARα蛋白的降解可能起到至关重要的作用。最新研究发现,相比于其它亚型,PML-V型蛋白具有低流动性,较强的多聚化功能,被认为可能是构成PML核小体(PML-NBs)的骨架蛋白。本课题前期研究发现,七种PML亚型对As203具有不同的敏感性,其中PML-V型蛋白最为敏感,并能够改变其它亚型蛋白对As2O3的反应性,暗示其在PML-RARα蛋白降解过程中发挥重要的作用。目前PML蛋白对As203的敏感性及其参与As203降解PML-RARα融合蛋白的分子机制仍未可知,有待于进一步探索。目的:1.探索不同PML亚型(PML-Ⅰ～Ⅵ)对As2O3的敏感性。2.鉴定PML-V的特异性结合蛋白,并揭示其功能和作用。3.阐明PML-V型蛋白在As2O3降解PML-RARα融合蛋白过程中的作用机理。4.发现PML-V型蛋白的新生物学功能。方法:1.同源重组法构建各缺失突变的质粒。2.免疫印迹法检测不同蛋白在核质(RIPA裂解液的可溶部分)及核基质(RIPA裂解液的不可溶部分)中的溶性变化。3.免疫荧光法检测不同蛋白在细胞中的定位。4.Blast方法对比不同种属间氨基酸序列的保守性。5.蛋白质组学鉴定相互作用蛋白。6.免疫共沉淀法检测蛋白-蛋白相互作用。7.荧光定量PCR法检测基因的mRNA水平变化。8.CRISPR/Cas9技术构建目的基因敲除的细胞系。结果:1.不同亚型的PML蛋白对三氧化二砷的敏感性研究在七种不同亚型的PML蛋白中,PML-V型蛋白对三氧化二砷最为敏感,即As203可快速诱导PML-V型蛋白的溶性改变(可溶性PML-V型蛋白从核质转移至不可溶核基质中——As203治疗APL的关键步骤);该过程由PML-V型蛋白特异性C端7ab区域介导,且不同种属间7ab序列具有高度保守性;蛋白质组学结果显示自噬相关蛋白p62(又称SQSTM-1)能够与PML-V型蛋白发生特异性相互作用;PML-V型蛋白可直接影响其它PML亚型蛋白的溶性改变速率。2.PML-V型蛋白与其特异性结合蛋白p62的相互作用研究PML-V型蛋白的C末端氨基酸序列(591-611aa)与p62蛋白中氨基酸序列(228-257aa)相互作用;PML-V型蛋白可招募p62蛋白入核并抑制其降解;p62蛋白在As203的作用下可与PML-V型蛋白共同在核基质中积聚;p62蛋白不参与As2O3诱导PML-V型蛋白溶性转变过程。3.PML-V型蛋白在As203诱导PML-R ARα融合蛋白降解过程中的功能研究p62蛋白可特异性促进PML-V型蛋白的泛素化,而对其它亚型无效;PML-V介导PML-RARα融合蛋白与p62蛋白的相互作用,促进其自噬溶酶体途径的降解;PML-V型蛋白与TRAF6蛋白竞争性结合p62蛋白,进而抑制IL-1β所诱导的NF-κB通路的激活。结论:本研究发现,在PML蛋白的七种亚型中,由于高保守性7ab区域的存在使得PML-V型蛋白具有其独特的生物学功能。首先,PML-V的反应敏感性显著高于其它亚型蛋白。其次,PML-V型蛋白能够特异性与p62蛋白结合,进而增强自身多聚泛素化和降解。另外,PML-V可同时与PML-RARα融合蛋白和p62蛋白相互作用,促进PML-RARα融合蛋白的自噬溶酶体途径降解。最后,PML-V型蛋白能够通过与TRAF6蛋白竞争性结合p62蛋白,抑制IL-1β所诱导的NF-κB通路的激活。本论文首次发现PML-V型蛋白在As2O3降解PML-RARα融合蛋白过程中起到关键作用,并阐明其分子机制。