研究背景脑出血（ICH）常伴有活性氧（ROS）诱导的氧化应激反应,这会引起持续的继发性脑损伤（SBI）,例如神经元死亡、血脑屏障受损等。有报道称ROS可直接触发神经元的死亡。由于大多数ROS是在线粒体中产生的,因此,抑制线粒体ROS的产生对减少ICH后的氧化应激引起的神经元细胞的死亡至关重要。NADPH氧化酶4（NADPH Oxidase 4,NOX4）是唯一在组织中可直接激活产生ROS而不需要簇状亚基调控的NADPH氧化酶亚型。然而,在脑出血后,NOX4是否介导线粒体ROS产生和神经元细胞的死亡尚不清楚。在本研究中,我们发现ICH诱导了 NOX4的表达增加,而NOX4的升高主要发生在神经元细胞中,最终引发神经元焦亡。通过构建腺相关病毒（adeno-associated virus,AAV）敲减NOX4,线粒体内ROS的生成明显减少,最终脑出血后的线粒体损伤得到缓解,神经元焦亡减少。此外,我们还发现,敲减NOX4后神经元细胞氧化应激反应减轻,并伴随对氧化应激耐受力的增强。最后,我们使用线粒体特异性ROS抑制剂（Mito-TEMPO）作为线粒体反向作用于NOX4的方式来治疗ICH,我们发现Mito-TEMPO抑制了 NOX4的表达和神经元焦亡,作用与敲减NOX4相似,这预示着NOX4很可能是抑制线粒体内ROS生成的重要靶点。总之,我们的研究表明,敲减NOX4可抑制线粒体内的ROS生成,减少脑出血后的神经元焦亡,同时增强了神经元对氧化应激的耐受力。研究目的明确NOX4在脑出血后神经元焦亡中的作用,从ROS产生的源头——线粒体入手,减少NOX4介导的ROS产生,阻断因ROS造成神经元焦亡的可能途径。通过实验证明脑出血后抑制NOX4的表达,是否可减少线粒体内的ROS产生,对神经元焦亡产生影响。研究方法利用立体定位技术构建大鼠脑出血模型并检测大鼠脑出血后NOX4表达;免疫荧光明确大鼠脑出血后NOX4的细胞空间定位;尼氏染色检测大鼠脑出血后神经细胞的死亡情况;透射电镜观察大鼠脑出血后神经元细胞的具体改变;利用腺相关病毒和shRNA-NOX4构建稳定可靠的AAV-NOX4,敲减大鼠脑内NOX4;利用Western Blot、免疫荧光、尼氏染色、透射电镜等实验技术对比敲减前后神经元及其线粒体的变化;通过Western Blot、免疫荧光染色等技术探寻其中所涉及的相关通路。研究结果1.NOX4在脑出血后脑组织中明显升高,且在72小时达到峰值。NOX4的升高与出血灶周围组织脑水肿严重程度成正比,其升高主要发生在神经元;2.敲减大鼠脑内NOX4,出血后脑水肿缓解,血脑屏障通透性下降;3.敲减大鼠脑内 NOX4,通过抑制 caspase1/GSDMD-N及 caspase4/11/GSDMD-C两条通路抑制神经元焦亡;4.敲减大鼠脑内NOX4,脑出血后脑组织内的ROS产生明显下降,并通过Nrf2/Keap-1通路增强神经元对氧化应激的耐受性;5.敲减大鼠脑内NOX4,线粒体内NOX4表达明显降低,神经元线粒体内的ROS生成明显减少,神经元线粒体损伤得到缓解;6.使用线粒体ROS特异性抑制剂Mito-TEMPO治疗脑出血后,脑出血后的NOX4生成受到抑制,神经元的焦亡明显减少,血脑屏障损伤减轻。结论1.NOX4的表达在脑出血后升高且与脑水肿严重程度成正比;2.2.脑出血后NOX4的升高主要定位于神经元;3.敲减大鼠脑内NOX4可有效缓解出血后脑水肿,保护血脑屏障;4.敲减大鼠脑内NOX4可降低大鼠脑出血后的神经元焦亡;5.敲减大鼠脑内NOX4可有效缓解大鼠脑出血后的氧化应激反应,并增强神经元对氧化应激的耐受性;6.敲减大鼠脑内NOX4可减轻大鼠脑出血后神经元线粒体损伤,缓解了脑出血后ROS不断叠加的恶性循环;7.Mito-TEMPO可抑制脑出血后NOX4的升高,减少神经元焦亡,NOX4可能是其作用位点。