论文部分内容阅读
鸭疫里默氏杆菌（Riemerella anatipestifer,RA）能感染鸭、鹅等多种宿主,引起严重渗出性炎症,给水禽养殖业造成了严重的经济损失。该细菌存在于全世界主要的养鸭国家和地区,血清型复杂,极易产生耐药性,感染发病动物以纤维素性肝周炎、心包炎和气囊炎为主要病例特征。补体C5a是补体裂解片段中过敏毒素作用最强的介质,主要通过与C5aR结合,形成信号轴,发挥其生物学作用。C5a-C5aR轴与败血症、脑膜炎等多种细菌性感染疾病有关,阻断C5a-C5aR轴可以降低感染程度,改善疾病发展状况。本研究在克隆、表达鸭C5a、C5aR基因及多抗制备基础上,建立RA雏鸭感染模型,探索C5a-C5aR轴在RA感染中的作用研究,为鸭传染性浆膜炎治疗提供新的思路。1鸭C5、C5aR基因的克隆与分析根据NCBI上登录的绿头鸭C5基因和C5aR的核苷酸序列设计引物,以10日龄健康四川麻鸭肝脏组织总RNA反转录合成的c DNA为模板进行PCR扩增、克隆及测序获得鸭C5aR及C5核苷酸序列,与绿头鸭C5aR序列（XM＿027447482.1）及C5序列（XM＿027470663.1）的相似性分别为99.8%和99.6%。2鸭C5a、C5aR基因片段原核表达和多克隆抗体制备根据氨基酸序列,人工合成鸭C5a和C5aR基因核苷酸序列,并与p ET32a构建原核重组表达载体,转化E.coli BL21,用终浓度0.4m M IPTG在30℃及180rpm振荡条件下诱导4h,获得良好表达,且重组融合蛋白为胞内可溶性形式存在。将诱导表达的菌液离心,收集菌泥,用生理盐水重悬,超声波裂解,离心收集的上清液进行SDS-PAGE,切取含有目的蛋白的凝胶条带,洗涤并匀浆后作为免疫抗原,免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。Western-blot检测结果显示抗血清能与重组融合蛋白结合,间接ELISA检测血清抗体效价为1:10000以上。3 C5a、C5aR多克隆抗体对RA刺激鸭外周全血的影响肝素钠抗凝制备的10日龄健康鸭外周血用RA在37℃、200rpm条件下作用,取样、离心制备血浆,用于检测C5a及细胞因子含量。实验中,探索了抗重组蛋白C5a及C5aR抗体对血浆中C5a及细胞因子含量的影响。鸭外周血与RA作用作用2h和4h时,血浆中C5a含量显著升高（p＜0.05）;作用4h时,细胞因子IL1β升高极显著（p＜0.01）;作用2h时,IL6和TNFα升高显著（p＜0.05）。在外周血与细菌作用过程,抗重组蛋白C5a抗体能显著下调4h时的血浆C5a、IL1β水平和2h时的血浆IL6、TNFα水平（p＜0.05）,抗重组蛋白C5aR抗体能显著下调4h时的血浆IL1β水平和2h时的血浆IL6水平（p＜0.05）。以上结果显示,鸭外周血受到RA刺激后C5a及细胞因子IL1β、IL6和TNFα表达上调,抗重组蛋白C5a及C5aR抗体能使受刺激全血中C5a、IL6、IL1β和TNFα含量下降。4探索抗重组蛋白抗体使用剂量及时间在10日龄健康鸭实验性感染RA中,于不同时间注射不同剂量的抗重组蛋白C5a及C5aR抗体,以动物的存活率为指标筛选抗体的使用剂量及时间。结果显示,在颈部皮下接种RA的同时,腿部皮下注射抗重组蛋白C5a抗体0.3m L/只或抗重组蛋白C5aR抗体0.5m L/只,在接种72h内动物100%存活,未使用抗体的感染组存活率为60%。5抗体阻断C5a-C5aR轴对RA感染雏鸭的影响在颈部皮下接种RA的同时,腿部皮下注射抗重组蛋白C5a抗体0.3m L/只或抗重组蛋白C5aR抗体0.5m L/只建立抗体阻断C5a-C5aR轴模型,同时设健康对照及RA感染组。在接种RA 72h内,RA感染组、抗重组蛋白C5a抗体处理组和抗重组蛋白C5aR抗体处理组动物的发病率为分别为60%、40%和40%及存活率分别为40%、100%和100%,而健康对照组动物无发病及死亡。在接种后24h、48h和72h,RA感染组捕杀鸭的纤维素性心包炎和肝周炎等大体病变、组织中嗜中性粒细胞增多等病理组织学变化较抗体处理组明显。以上结果显示,在人工接种RA时注射抗重组蛋白C5a抗体或C5aR抗体,能降低动物发病率及死亡率,减轻炎症及病理损伤。RA感染组鸭在接种后12h、24h和48h外周血中细菌数分别为3340CFU/m L、11060CFU/m L和182667CFU/m L,C5a抗体处理组鸭分别为1333CFU/m L、7553CFU/m L和13633CFU/m L,C5aR抗体处理组鸭分别为1853CFU/m L、6494CFU/m L和11433CFU/m L,而健康对照组动物外周血经培养无细菌生长。以上结果显示,抗重组蛋白C5a抗体或C5aR抗体能减少人工接种鸭外周血中RA的数量。与健康对照组比较,接种RA后48h的感染组鸭血清中ALT和AST显著下降（p＜0.05）,接种RA后72h的感染组鸭血清中AST含量下降极显著（p＜0.01）,与RA感染组相比,接种RA后48h和72h的C5aR抗体处理组和C5a抗体处理组鸭血清ALT和AST含量无明显变化。ELISA检测鸭血清中C5a和细胞因子的含量。与健康对照组相比,接种RA后48h的感染组鸭血清中C5a、TNFα含量升高极显著（p＜0.01）、IL1β含量升高显著（p＜0.05）,接种RA后72h的感染组鸭血清中C5a、IL1β、TNFα、IL6含量升高极显著（p＜0.01）。与RA感染组相比,C5aR抗体处理组鸭血清IL1β、TNFα、IL6含量显著降低（p＜0.05）,C5a抗体处理组鸭血清C5a、IL1β、TNFα、IL6含量显著降低（p＜0.05）。荧光定量PCR检测肝组织中基因m RNA表达。与健康对照组相比,RA感染组雏鸭肝组织中C5aR、Sph K1和TNFα的m RNA表达极显著上调（p＜0.01）、IL1β的m RNA表达显著上调（p＜0.05）。与RA感染组相比,C5a抗体处理组和C5a抗体处理组肝组织中C5aR、IL1β和TNFαm RNA的表达显著下调（p＜0.05）,而Sph K1极显著下调（p＜0.01）;以上结果显示,抗重组蛋白C5a抗体或C5aR抗体能降低感染鸭C5aR、IL1β、TNFα和Sph K1的表达。本研究利用体外全血及动物感染模型研究发现,C5a-C5aR轴在鸭疫里默氏杆菌感染中具有重要的调控作用,利用抗体阻断该轴有利于减轻感染程度。