羊痘病毒(Capripoxvirus,CPV)是山羊痘病和绵羊痘病的病原。结构蛋白P32是CPV的特异蛋白,包含病毒粒子的主要抗原决定簇,并且P32基因具有很高的保守性,对CPV具有诊断意义。 本实验根据GenBank中发表的山羊痘病毒(Goat pox virus,GTPV)P32基因序列,利用软件Primer 5.0分别设计了P32鉴定和表达用引物。从感染羊痘的山羊和绵羊痂皮以及山羊痘病毒疫苗感染的羊胎皮肤细胞培养物中提取DNA,利用PCR方法分别扩增出大约1kb的DNA片段,将其插入克隆载体pMD18-T并测序。结果表明:GTPV P32基因开放阅读框(ORF)全长969bp,编码323个氨基酸;绵羊痘病毒(Sheep pox virus,SPPV)P32基因ORF全长972bp,编码324个氨基酸;羊胎皮肤细胞分离毒(FGD-CPV)P32基因ORF全长969bp,编码323个氨基酸。将基因序列与GenBank上已公布的P32基因序列相比较,各基因间序列相似率很高,证明CPV的P32基因高度保守。 实验中构建了带有完整P32基因的Bac-to-Bac杆状病毒表达载体Bac-Bac1-P32、Bac-BacHTa-P32和大肠杆菌表达载体pPRO-P32。将Bac—Bac1-P32、Bac-BacHTa-P32转染sf9细胞,pPRO-P32转化大肠杆菌后,均未见目的蛋白的表达。 以PCR方法扩增了切去跨膜结构的P32基因片段,构建了表达部分P32基因的大肠杆菌表达载体pPRO-TRUNCP32,转化大肠杆菌BL21(DE3),经诱导表达出特异的31kDa融合蛋白,蛋白以包涵体形式存在。 本试验为羊痘病快速有效诊断方法的建立和CPV的分子生物学特性的研究奠定了基础。