【研究背景】炎症的本质是机体对各种损伤性刺激的一种防御反应,而炎症反应也是恢复组织稳态和促进自我修复的生理基础。在自然界中,低等脊椎动物（斑马鱼等）的机体组织修复能力明显强于哺乳动物,而快速启动且短暂持续的时序性炎症反应是其高效组织再生模式的决定因素。同时人类的口腔黏膜创面相较于皮肤创面愈合速度快且无瘢痕形成,更快速可控的急性炎症反应是促进组织修复和重建生理结构的主要影响因素。最新研究发现,在严重损害造成的极限骨量缺失和糖尿病导致的皮肤病损动物模型中,不足或缓慢失调的组织炎症反应会显著降低机体再生效能,导致难愈性创面形成;而通过引发适度的急性炎症反应可以促进组织的修复与重建。能否精准调节炎症反应模式-诱发急性炎症的快速触发和及时消除,适度缩短炎症进程进而促进严重损伤组织愈合,成为学者们的攻关目标。炎症反应是一个精确调控的生理过程,中性粒细胞和巨噬细胞作为炎症反应的核心细胞,有序协调地发挥清除感染源和受损组织细胞,促进组织修复与再生的作用。中性粒细胞的迁移是炎症反应启动的标志,作为最早到达感染或损伤区域的免疫细胞,通过分泌细胞因子和趋化因子并且募集其他免疫细胞,在炎症早期发挥阻止和控制感染源侵袭的重要作用。然而中性粒细胞过度浸润或持续活化会引发慢性炎症甚至加重周围组织损伤,因此中性粒细胞完成趋化、活化、吞噬等使命后应当被及时清除,中性粒细胞适时凋亡是降低炎性诱导介质和启动炎症反应消退的必要条件。凋亡的中性粒细胞被巨噬细胞吞噬,可以刺激巨噬细胞转化为抗炎表型,进而诱导相关干细胞的归巢、增殖和分化,从而恢复组织稳态和启动组织修复。基于前期研究结果,我们课题组提出假设:通过时序性地调控中性粒细胞的趋化和凋亡,进而促进巨噬细胞向抗炎表型转化,重塑炎症反应进程,以期促进难愈性病损的组织再生。中性粒细胞的募集受多种趋化信号调控,而fMLP（N-formylmethionyl-leucyl-phenyl-alanine,N-甲酰甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸）是一类由细菌或损伤线粒体产生的N-甲酰基肽,在中性粒细胞早期募集过程中发挥关键作用。此外中性粒细胞凋亡主要通过自发性生理凋亡和死亡受体配体引发的外源性凋亡两种途径实现,而Fas/FasL是中性粒细胞凋亡的重要外源性信号。研究显示,新型控释生物材料-水凝胶（Gel等）与纳米粒子（SiO2等）复合物具有结构多样性和药物精确递送等优势,可以通过装载特异性生物分子对细胞生物学行为进行精确时空调控。因此本研究拟设计和制备一种复合生物材料Gel@fMLP/SiO2-FasL,其原理如下:材料于损伤部位应用后可以爆释fMLP,能够快速募集中性粒细胞;而后利用活化中性粒细胞发挥作用产生的酸,降解p H响应性水凝胶,促进SiO2粒子表面的FasL暴露于组织环境中,进而诱导活化中性粒细胞凋亡;最后凋亡中性粒细胞可以被巨噬细胞内吞,刺激其转化为抗炎表型,形成有利于组织再生的微环境。利用这种新型复合生物材料的控释功能,调控中性粒细胞引导的时序性炎症反应,以期为难愈性组织病损的治疗奠定研究基础。【研究目的】本研究首先构建复合生物材料Gel@fMLP/SiO2-FasL,检测其物理化学性能,验证其具有爆释趋化因子fMLP,p H响应性释放SiO2-FasL的两阶段精确控释能力。其次建立细胞共培养体系,检测复合生物材料促进中性粒细胞迁移和诱导活化中性粒细胞凋亡的序列作用,评估内吞中性粒细胞后巨噬细胞的表型转化情况,进而验证Gel@fMLP/SiO2-FasL对炎症相关细胞生物学行为的调控作用。随后构建小鼠颅骨临界骨缺损模型,观察Gel@fMLP/SiO2-FasL应用后的骨缺损修复情况和组织局部炎症反应程度,明确其调控中性粒细胞引导的时序性炎症反应促进临界骨缺损再生的功能。最后构建糖尿病皮肤缺损模型,观察Gel@fMLP/SiO2-FasL应用后皮肤创面的愈合情况和局部组织炎症反应模式,验证其通过重塑炎症反应进程而促进糖尿病皮肤创面愈合。本研究以期建立中性粒细胞募集和凋亡时序调控的新型技术体系,重塑炎症反应进程促进组织再生,为临床难愈性组织病损治疗提供新思路和新方法。【研究方法】1.复合生物材料Gel@fMLP/SiO2-FasL的构建与性能研究。首先应用4-甲酰基苯硼酸修饰壳聚糖（CS-FPBA）制备凝胶基质,采用核磁共振波谱仪和紫外光分光光度计评估材料修饰情况;其次在SiO2纳米粒子上接枝FasL制备SiO2-FasL,利用透射电镜和纳米粒径分析仪检测纳米粒子的形貌、尺寸和zeta电位;随后制备含有fMLP和SiO2-FasL的复合生物材料,通过扫描电镜、傅立叶变换红外光谱仪、流变仪检测Gel@fMLP/SiO2-FasL形貌、内容物和机械性能;最后利用荧光分光光度计动态观察有效载荷荧光,计算fMLP和SiO2-FasL释放百分率。2.复合生物材料调控炎症相关细胞生物学行为的作用研究。首先分离培养小鼠骨髓来源中性粒细胞和巨噬细胞,流式细胞术鉴定其分子表型;其次应用transwell将中性粒细胞与复合生物材料（Gel@fMLP/SiO2）共培养,应用流式细胞术和免疫荧光染色计数迁移细胞数量;随后将活化中性粒细胞与纳米粒子（SiO2-FasL）共培养,流式细胞术检测凋亡细胞百分比,Western blot检测中性粒细胞凋亡相关蛋白表达水平;最后将纳米粒子（SiO2-FasL）诱导的中性粒细胞与巨噬细胞共培养,免疫荧光染色观察巨噬细胞的表型变化,Western blot检测巨噬细胞表型相关蛋白表达,ELISA检测共培养上清中细胞因子表达水平。3.Gel@fMLP/SiO2-FasL促进小鼠颅骨临界骨缺损修复的功能研究。首先制备小鼠颅骨临界骨缺损模型,将Gel@fMLP/SiO2-FasL局部应用到缺损创面;其次应用Micro-CT检测治疗后8 w颅骨缺损修复情况,继而采用H＆E和Masson染色观察骨组织形成情况;最后免疫荧光染色观察Gel@fMLP/SiO2-FasL应用后短期内缺损处中性粒细胞、巨噬细胞浸润情况,中性粒细胞凋亡比例和细胞因子表达情况。4.Gel@fMLP/SiO2-FasL促进糖尿病小鼠皮肤缺损创面愈合的功能研究。首先构建Ⅰ型糖尿病小鼠模型,制备小鼠背部全层皮肤缺损,观察正常小鼠与糖尿病小鼠的皮肤缺损愈合差异,流式细胞术和免疫荧光检测皮肤创面中性粒细胞和巨噬细胞的浸润情况;其次将Gel@fMLP/SiO2-FasL局部应用到糖尿病小鼠皮肤创面处,明确复合生物材料对创面愈合的促进作用,H＆E和Masson染色观察皮肤组织的再生情况;最后流式细胞术和免疫荧光检测皮肤创面中性粒细胞和巨噬细胞浸润情况,免疫荧光检测中性粒细胞的凋亡百分比,ELISA检测皮肤缺损处炎症因子表达水平。【研究结果】1.成功制备复合生物材料Gel@fMLP/SiO2-FasL,其具备爆释fMLP和低p H条件下释放SiO2-FasL的能力:首先在壳聚糖上接枝4-甲酰基苯硼酸成功制备凝胶基质CS-FPBA;其次SiO2纳米粒子表面有效负载FasL形成SiO2-FasL;随后将趋化因子fMLP和SiO2-FasL装载于水凝胶内构建复合生物材料Gel@fMLP/SiO2-FasL,其可以承受较大的变形力作用,保持完整的三维网络结构,稳定性较好;最后体外模拟机体环境下复合生物材料的作用特点,其可以快速释放fMLP,并且在酸性条件下释放SiO2-FasL。2.复合生物材料可以募集中性粒细胞,诱导活化中性粒细胞凋亡,促进巨噬细胞向抗炎表型转化:首先证实含有fMLP的复合生物材料能够促进中性粒细胞迁移;其次SiO2-FasL能够诱导活化中性粒细胞凋亡;随后SiO2-FasL诱导的中性粒细胞能够促进巨噬细胞由促炎表型向抗炎表型转化,同时抑制促炎因子肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）和白介素-6（interleukin-6,IL-6）表达,促进抗炎因子转化生长因子-β（Transforming growth factor-β,TGF-β）和IL-10分泌。3.Gel@fMLP/SiO2-FasL促进小鼠颅骨临界骨缺损修复:首先明确复合生物材料可以显著促进小鼠颅骨临界骨缺损修复;其次其能够促进缺损处中性粒细胞的快速募集和及时凋亡;最后发现其促进缺损部位促炎型巨噬细胞的浸润和向抗炎型巨噬细胞表型转化,并且下调促炎因子TNF-α表达水平和促进抗炎因子TGF-β的表达。4.Gel@fMLP/SiO2-FasL加速糖尿病小鼠皮肤缺损创面愈合:首先成功建立Ⅰ型糖尿病小鼠模型,发现模型小鼠皮肤缺损愈合速度显著低于正常小鼠,其创伤发生后炎症反应的启动较迟缓,后期炎症持续时间延长;其次应用复合生物材料可加速糖尿病小鼠皮肤缺损创面愈合;随后发现创面组织中中性粒细胞数量显著增多,促炎型巨噬细胞浸润水平升高,继而发现凋亡中性粒细胞数量增多,抗炎型巨噬细胞比例增高,促炎因子TNF-α、IL-6表达水平降低,抗炎因子TGF-β、IL-10表达水平升高。【研究结论】1.成功构建新型复合生物材料Gel@fMLP/SiO2-FasL,其具备时序性控释fMLP和FasL的生物学性能。2.复合生物材料首先能够募集中性粒细胞,适时诱导活化中性粒细胞凋亡,进而促进巨噬细胞转化为抗炎表型,可用于调控炎症反应进程。3.Gel@fMLP/SiO2-FasL能够引发颅骨临界骨缺损处瞬时高强度炎症反应,激发内源性再生潜能,促进骨缺损修复。4.Gel@fMLP/SiO2-FasL可重塑糖尿病皮肤缺损处慢性炎症反应为瞬时高强度过程,促进皮肤创面愈合。本研究基于引发适度的急性炎症反应可以促进组织修复与重建的创新理论,国际首次建立了新型复合生物材料Gel@fMLP/SiO2-FasL制备的技术体系,明确了其通过精确调控中性粒细胞募集和凋亡引导时序性炎症反应的生物学作用,验证了其重塑损伤部位炎症反应促进颅骨临界骨缺损修复和糖尿病皮肤创面愈合的生物学功能,为颅颌面复杂损伤的再生修复治疗奠定研究基础和提供新策略。