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禽大肠杆菌病一直是养禽业中常发生的原发或继发性细菌病,对养禽业造成不小的威胁和损失。抗菌药在这些疾病的控制中发挥着非常重要的作用。目前,现有禽病原性大肠杆菌的研究资料绝大多数来源于鸡,而作为世界上养鸭最多的国家,随着抗菌药应用范围的扩大,在鸭中分离到的大肠杆菌耐药性越来越严重,已成为人类健康和养禽业发展的重要影响因素。到目前为止,对鸭源致病性E.coli耐药性研究缺乏系统资料,因此,很有必要对鸭源大肠杆菌的多重耐药性、特异性耐药机制、非特异性耐药机制产生及对耐药性贡献的关系进行研究,从而为探讨耐药性产生和调控的机制,控制耐药性进一步发展和开发针对性的药物具有重要意义。本文主要进行了以下几个方面的研究:（一）利用VITEK-32全自动细菌鉴定仪对从河南、福建、广东、辽宁、安徽、山东等地区养鸭场采集病死鸭分离的菌株进行鉴定,共获得108株鸭源大肠杆菌,采用CLSI推荐的微量稀释法测定以上鸭分离菌株对氟喹诺酮类、β-内酰胺类、氨基糖苷类、四环素类、氯霉素类等19个药物或组合的MIC值,并分析多重耐药表型。结果发现分离菌株除了碳青霉烯亚胺培南全部敏感外,62.0%～72.2%的菌株对氟喹诺酮类药物耐药,31.5%～64.8%的药物对三代头孢耐药,超过92.6%的菌株对经典的β-内酰胺类药物耐药,41.7%～70.4%的菌株对此类药物和酶抑制剂联用制剂耐药。仅有4株菌株耐1～5种药物,其余菌株均耐6种药物以上,占总菌株数的96.3%,河南、山东来源菌株耐药最为严重。超广谱β-内酰胺酶检测结果表明36.1%（39/108）的受试菌为产ESBLs菌株,产和非产ESBLs菌株对四种头孢类药物的耐药率分别介于33.1%～89.7%、30.4%～37.7%之间,对喹诺酮类药物耐药率则分别介于74.4%～84.6%、53.6%～62.3%之间。（二）应用微量稀释法检测临床分离菌株加入主动外排抑制剂碳酰氯间氯苯腙（CCCP）、利血平前后对多西环素、左氧氟沙星最低抑菌浓度（MIC）变化,以此判断大肠杆菌主动外排阳性率,通过荧光定量PCR检测不同耐药程度临床菌株主动外排基因mRNA相对表达量,分析受试菌株的耐药程度和mRNA水平的相关性,结果显示,利血平作为外排抑制剂时,分离菌株对多西环素、左氧氟沙星的外排阳性率分别为55.6%、24.1%,CCCP作为外排抑制剂时,菌株对二者的阳性率分别为45.4%、41.7%。临床分离株无论耐药与否,都能扩增到acrA、acrB、tolC基因的目的条带,无基因缺失发生,选择的2株代表性菌株的序列与NCBI上序列同源性为100%,无突变发生。菌株耐药程度和acrA, acrB, acrD, acre, acrF, mdtA基因mRNA的相对表达量正相关,3株耐18种药物的高水平耐药菌株的以上外排基因的相对表达量分别介于2.88～4.53、2.28～2.63、10.11～24.26、6.22～11.93、7.03～11.26、2.90～4.00之间。3株耐10种药物的菌株的表达量高于标准菌株的表达,敏感株的表达量和标准菌株表达量接近。（三）采用和第二章类似的方法,测定不同耐药程度菌株主动外排调控基因marA, soxS, robA相对表达量的差异,结果表明marA, soxS基因的表达量和临床分离株的耐药程度正相关。3株耐18种药物的菌株的marA基因表达量分别为2.58、2.83、1.85,soxS基因的表达量为3.89、3.05、2.10,但robA基因的表达量均低于标准菌株ATCC25922。（四）采用1/2MIC阿米卡星、环丙沙星、头孢曲松三种药物诱导培养标准菌株O73至30代,结果发现敏感的标准菌株在以上药物作用下能进化为多重耐药菌株。头孢曲松作为诱导剂最容易产生诱导耐药性。敏感菌株首先对阿莫西林、左氧氟沙星、环丙沙星、多西环素产生诱导耐药性,其次是氟苯尼考、加替沙星、阿米卡星、氨苄西林,头孢曲松、头孢噻呋、头孢噻肟、磷霉素,头孢吡肟、新霉素最不容易产生诱导耐药性,亚胺培南不会被以上三种诱导剂诱导产生耐药。PCR检测诱导菌株耐药相关基因,结果部分菌株扩增到TEM, OXA-1, rmtB, qnrD, qnrS, aac（6’）-Ib-cr等耐药基因。药物诱导能使标准菌株的主动外排基因表达量增加,但阿米卡星诱导20代的菌株多数外排基因表达量下降。药物诱导能使菌株主动外排调控基因marA, soxS表达量先下降,然后再上升,环丙沙星诱导至20代的菌株marA基因mRNA的表达水平最高,标准菌株的2.30倍,其余高于母体菌株表达的菌株为CIP10, CRO30, CIP30, AMK20。对于soxS基因,在诱导菌株中,AMK20的表达量最高,为5.98,除了头孢曲松诱导的10代菌株和阿米卡星诱导的30代菌株略低于母体菌株外,其余诱导菌株的表达量均高于母体菌株soxS基因的表达;除了环丙沙星诱导的10代菌株的表达量高于母体菌株外,其余临床分离株、诱导耐药株的robA基因表达量都低于大肠杆菌ATCC25922的表达量。药物诱导引起标准菌株O73 acrA, acrB, tolC基因的碱基及氨基酸的突变,但不会使三者缺失。acrA基因环丙沙星诱导后,有1处碱基发生变异;但经头孢曲松诱导后,CRO10有7处发生变异,有1处引起了氨基酸的改变,为T103A,CRO20, CRO30有1处变异,环丙沙星诱导的变异位点与此相同;acrB基因经阿米卡星诱导至20和30代时,有10处碱基变异,且有1处引起氨基酸的突变,为V447I;环丙沙星诱导均有10处碱基发生变异,且第10、20、30代的变异位点一致;头孢曲松诱导10代时,也有10处碱基发生变异,诱导至20代和30代的菌株,其碱基突变位点和环丙沙星诱导的变异位点一致;tolC基因经阿米卡星诱导至20和30代时,有9处碱基突变;环丙沙星诱导有4处碱基发生变异;头孢曲松诱导至10代,7处碱基发生变异,且有A245T氨基酸的改变;但20和30代菌株的突变位点和环丙沙星诱导一致。