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目的:构建重组质粒p OTBar-FGF18,转化到根癌农杆菌EHA105,利用该表达菌细胞中含有Ti(Tumour inducing)质粒,其上的T-DNA(Transferring DNA)区域侵染植物后可插入到植物基因组中,从而将FGF18插入到植物基因组中并通过减数分裂稳定的遗传给后代。拟南芥为模式植物,其未开放的花蕾可以被农杆菌侵染,将目的基因插入到拟南芥基因组中,而农杆菌可以通过切开的红花子叶结进入红花组织,整合进其基因组。考察油体系统表达的FGF18对成纤维细胞NIH3T3繁殖过程中的作用。方法:在NCBI上查找到人FGF18的序列,将其进行植物偏好优化后送至公司合成。提取含有p OTBar载体和FGF18目的基因的质粒,Nco I和Hand III双酶切后获取p OTBar载体片段和FGF18目的片段,将两个片段用T4连接酶连接,构成重组质粒oleosin-FGF18。将重组质粒转化到大肠杆菌感受态细胞DH5a中,验证阳性菌并保存菌种。从阳性大肠杆菌中提取质粒,转化到制备号的农杆菌EHA105感受态中,验证阳性菌后保留菌种。拟南芥用阳性农杆菌侵染后,正常培养至收获种子,即T1代种子。将T1代种子播种后,草铵膦(basta)筛选得到转基因拟南芥苗,之后叶片基因组PCR实验、SDS-PAGE和Western blotting进一步验证转基因苗,将确认为转基因的阳性苗进行蛋白含量测定和活性验证。活性验证以实验室大肠杆菌系统表达的FGF18为阳性对照,野生型拟南芥油体蛋白为阴性对照,验证油体蛋白的生物活性。红花子叶侵染后,对其进行组织培养,得到小苗后嫁接。结果:成功构建oleosin-FGF18表达载体,并且转化至农杆菌,为农杆菌介导侵染做准备。拟南芥叶片基因组PCR结果表明,在552bp左右有条带,与理论FGF18的大小一致,SDS-PAGE和Western blotting的结果显示融合蛋白oleosin-FGF18在39.7KDa大小有条带,与理论值相符。拟南芥中表达的融合蛋白含量达到每克种子455ug,占总油体总蛋白的0.29%。MTT实验显示含有融合蛋白oleosin-FGF18的油体蛋白和阳性FGF18蛋白对NIH3T3细胞均具有显著的促增殖活性,且成剂量依赖性,是否加入肝素对活性无影响,而野生型拟南芥油体蛋白无促增殖活性。红花种子培养过程中,种子基本萌发,萌发率达到95%以上。共培养和抑菌培养后,芽点长出约有50%,但是能转移到伸长培养基的芽点较少。生根培养阶段,生根情况不理想,采用嫁接方式,使具有basta抗性的红花小苗进一步生长,收获种子。结论:Oleosin-FGF18重组蛋白成功在拟南芥种子中得到表达,并且具有对NIH3T3的促增殖活性,为油体系统表达FGF18蛋白扩大化生产具有重大参考价值。融合蛋白具有其独特性,能直接外用于皮肤和促进皮肤吸收,从而能为开发直接外用型药物提供参考。农杆菌介导法转化红花暂时并未得到表达FGF18的阳性苗。