非受体酪氨酸激酶c-abl基因位于人的9号染色体上,是Abelson鼠白血病病毒v-abl原癌基因在哺乳动物细胞内的同源基因,其编码的蛋白c-Abl通过与多种底物相互作用,在细胞增殖与分化、细胞周期调控、细胞黏附与迁移、氧化应激、DNA损伤修复以及机体免疫调节等生命活动中发挥重要作用。真核生物细胞骨架由微丝、微管及中间纤维组成,其中,微管主要由α/β-微管蛋白(α/β-tubulin)异二聚体聚合而成,具有高度的动态性,Y-微管蛋白(γ-tubulin)不是微管组成成分,主要位于微管组织中心(microtubule-organizing center, MTOC),与多种其他蛋白形成微管成核复合物,参与微管的成核。中间纤维分为5种类型,分布于不同种类的细胞,为每种细胞提供独特的细胞骨架网络结构。三种细胞骨架各有特点但彼此相互联系,共同参与调节细胞迁移、细胞分裂、细胞形态维持等重要过程。已有研究表明,c-Abl具有肌动蛋白结合结构域(G/F-actin binding domain),可与微丝相关重塑蛋白相互作用进而调节微丝骨架动态平衡,在细胞黏附、细胞迁移以及伪足形成等过程中发挥重要作用。本实验室前期研究结果提示c-Abl对微管骨架也具有调节作用,但其调控机理尚不明确。本研究首先利用免疫沉淀和免疫印迹方法证实,c-Abl激酶与α/β/γ-tubulin存在相互作用,且与γ-tubulin的相互作用最为显著,H202介导c-Abl激酶活化能显著增强其与γ-tubulin的相互作用。运用原位检测蛋白质相互作用技术(Duolink技术)发现,c-Abl与γ-tubullin的相互作用受细胞周期调节。进一步研究发现,c-Abl激酶可使α/γ-tubulin酪氨酸磷酸化,且γ-tubulin的酪氨酸磷酸化依赖于c-Abl激酶活性。运用细胞周期同步化方法发现,γ-tubulin酪氨酸磷酸化水平随细胞周期改变。利用LC-MS/MS串联质谱技术鉴定出γ-tubulin存在5个酪氨酸磷酸化修饰位点,即Tyr60、Tyr82、Tyr92、Tyr366及Tyr443。此外,我们还发现c-Abl可提高γ-tubulin的表达水平并抑制其泛素化降解,增强γ-tubulin的稳定性。为了研究c-Abl是否通过γ-tubullin磷酸化修饰调节细胞微管骨架的形成,我们从细胞中分离了聚合和解离状态的a-tubulin,发现在c-Abl激酶敲低的细胞中解离态的微管蛋白所占比例升高,提示c-Abl激酶可抑制微管解聚。同时,利用微管解聚药物nocodazole处理细胞,经免疫荧光染色观察微管结构发现,c-Abl激酶敲低的细胞对微管解聚药物敏感性增加,同样表明c-Abl激酶可抑制微管解聚,稳定微管骨架。由于γ-tubulin位于微管组织中心,参与微管成核,因此,我们推测c-Abl激酶对微管细胞骨架的调节作用可能与其对γ-tubulin的磷酸化修饰有关。此外,质谱鉴定提示,氧化应激可调节c-Abl与中间纤维蛋白vimentin及cytokeratin间的相互作用。进一步研究发现,c-Abl可使cytokeratin酪氨酸磷酸化。c-Abl可影响vimentin在细胞内的表达,当c-Abl表达敲低或激酶活性被抑制,vimentin的表达均下降。由于vimentin的表达水平与某些肿瘤细胞的侵袭能力正相关,且细胞侵袭实验也表明,c-Abl缺失或活性抑制可降低SW480或A549细胞的侵袭能力,据此推测该过程可能与c-Abl对vimentin表达水平的调节有关。综上所述,本研究发现c-Abl激酶能与微管蛋白相互作用并使y-tubulin酪氨酸磷酸化,提示y-tubulin在微管组织中心的功能受c-Abl激酶调节,为c-Abl对微管骨架调节机理的阐明提供了思路。c-Abl对中间纤维蛋白vimentin及cytokeratin的影响,为探索c-Abl对中间纤维骨架的动态调节以及肿瘤细胞侵袭的影响提供了线索。