目的:作为一种消化道恶性肿瘤,胰腺癌约90%是起源于腺管上皮的导管腺癌,近年来发病率和死亡率明显上升,且五年生存率不足5%,是预后最差的恶性肿瘤之一,其不良预后主要表现为较高的转移倾向和对放化疗的高抵抗性。白细胞介素是一种在白细胞和免疫细胞之间相互作用的淋巴因子,在介导T、B细胞活化、增殖与分化以及炎症反应中起着重要作用。目前白介素已成为肿瘤细胞研究关注的焦点因子。已发现38种白细胞介素,分别被命名为IL1~IL38。许多文献表明,白介素家族中IL6,IL8和胰腺癌有着密切的联系,这为胰腺癌的早期诊断及治疗提出了新的思路。研究发现IL6与其受体结合后可以使酪氨酸激酶家族成员活化。酪氨酸激酶家族成员的活化又可以激活下游多种通路,如MAPKs、PI3Ks、STATs,而这些通路参与调控了细胞增殖、存活和代谢调节以及间质纤维化等生物学行为。目前已发现IL6在多种肿瘤中存在过表达现象,在肿瘤的发生、发展中起重要作用。研究证实慢性炎症在肿瘤形成的过程中发挥关键的作用,而IL6是一种与肿瘤相关的炎症因子,在恶性肿瘤微环境中存在高表达,具有增加肿瘤的侵袭能力、促进肿瘤远处转移及血管生成、参与肿瘤耐药性的形成、调控间质纤维化等作用,所以深入研究IL6作用于恶性肿瘤的机制,有助于揭示微环境与实体肿瘤相互联系的分子基础,能够为肿瘤微环境中炎症因子IL6成为肿瘤治疗的新方向奠定基础。IL8是首个被发现的趋化因子,在炎症过程中起重要作用。随着对其作用机制的深入研究,发现IL8也具有促有丝分裂、血管生成等作用,IL8通过激活C-X-C基序趋化因子受体1(CXCR1)和CXCR2(两种细胞表面G蛋白偶联受体)调控癌症中的细胞增殖,迁移和侵袭。临床研究表明,IL8在PDAC患者中始终高表达,其在胰腺癌中的上调与胰腺癌的转移潜能增加和总体紊乱预后相关。最新的研究也证实,IL8也在调控肿瘤微环境方面发挥作用,IL8-CXCR1信号通路能够激活肿瘤干细胞的自我更新和再生。BAG家族蛋白最初是因为其与抗凋亡蛋白Bcl-2结合,可促进细胞生存,因此而得名。BAG3蛋白主要分布于细胞浆,其结构域主要包括WW结构域,能够与Bcl-2和分子伴侣热休克蛋白(HSP)家族成员相互作用的BAG结构域,和富含脯氨酸的PXXP基序(P代表脯氨酸,X代表任意氨基酸残基)。由于BAG蛋白家族C末端存在保守的BAG功能域,它能与热休克蛋白HSP70/HCP70相互作用,正负调节此类分子伴侣的功能,产生广泛的细胞生物学效应,因此BAG家族蛋白也被公认为是共分子伴侣(Co-chaperone)。除骨骼、心肌组织、脑组织及周围神经组织BAG3具有较高表达水平之外,在其它正常组织中BAG3的表达很弱或者不表达;而在一些肿瘤细胞如白血病、实体性肿瘤细胞内BAG3表达水平较高,维持肿瘤细胞的存活。本实验的前期工作结果表明BAG3能够调控胰腺癌恶化进程,并且发现细胞白介素家族成员IL6及IL8的表达随BAG3的下调而下调。本课题组前期已经证实,BAG3是一种RNA结合蛋白与转录后调控密切相关。鉴于肿瘤微环境在癌症治疗中的重要意义及转录后调控在基因表达的重要作用,本实验旨在前期工作基础上明确BAG3对胰腺癌恶化进程的调节,并进一步探索BAG3在转录后水平调控IL6及IL8表达的具体机制。研究方法:培养胰腺癌细胞及胰腺星形细胞,利用慢病毒感染的方法构建稳定敲低BAG3和空载体的SW1990、BxPC3细胞系。1、利用qRT-PCR检测目的mRNA的表达水平。2、利用Westernblot检测目的蛋白质的表达水平。3、利用Elisa检测上清液中相关因子释放。4、利用EdU掺入检测细胞增殖能力;Transwell检测细胞迁移和侵袭能力。5、利用组织芯片进行BAG3特异性免疫组化染色,分析患者样本中BAG3表达与细胞纤维化相关性。6、利用新生RNA捕获试剂盒检测新生目的mRNA的表达;应用RNA的合成抑制剂,qRT-PCR检测目的mRNA的半衰期。7、利用双荧光素酶报告基因系统检测启动子或其他元件的活性。8、利用RNA结合蛋白免疫沉淀和生物素pull-down实验检测RNA与蛋白的相互作用。9、利用免疫沉淀检测相关蛋白质之间的相互作用。结果:1、BAG3敲低降低了由PDAC产生的IL6并且降低了PDAC对HPanSteC的活化。2、BAG3敲低通过抑制IL6的产生从而降低HPanSteC的活化。3、在PDAC中BAG3敲低依赖Ago2通过3’UTR调控IL6 mRNA的去稳定。4、BAG3敲低通过增加Ago2 Ser387的磷酸化促进其募集至IL6 mRNA上。5、BAG3敲低通过减少IL8的产生抑制PDAC的迁移和侵袭。6、BAG3敲低通过其3’UTR调节IL8 mRNA的稳定性。7、BAG3敲低通过增加HuR Ser202的磷酸化来调控IL8 mRNA的稳定性。8、miRISC参与PDAC中BAG3敲低调控IL8mRNA的去稳定性过程。9、miRISC和HuR共同参与了BAG3敲低调控IL8mRNA稳定性的过程。10、PDAC中miR-4312与HuR竞争性的与IL8 mRNA相互作用并通过BAG3敲低抑制IL8表达。11、胰腺癌组织样本中BAG3和IL8表达呈正相关。结论:1、在PDAC中,BAG3通过增加Ago2 Ser387的磷酸化抑制其加载到IL6 mRNA促进IL6的释放,从而活化PSC,影响胰腺导管腺癌的发展。2、在PDAC中,BAG3的敲低一方面通过促进HuR Ser202的磷酸化抑制其与IL8mRNA的结合,另一方面上调Ago2磷酸化,促进IL8与包含miRNA-4312的miRISC结合,促进IL8的降解,从而降低PDAC的迁移和侵袭。