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山羊痘是由山羊痘病毒(Goat pox virus，GPV)引起的一种急性、热性、接触性传染病。本病以发热、无毛或少毛部位皮肤黏膜发生丘疹和疱疹以及淋巴结病变为主要特征，被世界动物卫生组织(OIE)列为A类重要传染病。我国从40年代起出现了绵羊痘和山羊痘的感染与流行，近几年我国各地特别是内蒙、西部地区常有羊痘感染的报道。该病发病率高，可导致妊娠母羊流产，羔羊死亡率高，并有非典型症状及继发、并发感染的情况。羊痘在我国的广泛流行，给我国养羊业以及毛皮加工行业的发展造成了极大的经济损失。目前对于羊痘尚无特异的治疗方法，主要依靠疫苗接种来预防。弱毒疫苗免疫效果比较好，而且免疫保护期长，但是现有诊断方法无法区分自然感染和弱毒疫苗免疫的动物，给疾病的鉴别诊断带来了困难。口蹄疫(Foot and mouth，FMD)是由口蹄疫病毒(Foot and mouth virus，FMDV)引起猪、牛、羊等偶蹄兽的一种急性热性高度接触性传染病，严重危害家畜的生产力和畜产品质量，给畜牧业和进出口贸易造成较大的经济损失，成为世界各国检疫和防疫的重点对象，同样被OIE列为A类重要传染病。虽然山羊和绵羊不如牛和猪易感，但是山羊和绵羊感染FMDV后会长期带毒，成为隐性带毒者，这给该病的防制增加了难度。因此，山羊和绵羊在FMDV的流行和传播过程中起着重要作用。VP1是FMDV的主要结构蛋白，它暴露在病毒颗粒的表面，具有与细胞受体结合的位点，是病毒感染细胞的关键，而且VP1能诱导产生FMDV中和抗体，因此VP1成为研制基因工程疫苗的首选靶抗原。本研究以我国广泛使用的山羊痘弱毒疫苗株AV41为亲本病毒，以胸苷激酶(thymidine kinase，TK)基因为外源基因插入位点，构建重组山羊痘病毒。首先，克隆GPV基因组中包含TK基因的ORF64-ORF67片段作为同源臂，将其克隆至pMD18-T simple载体，得到重组质粒pTK。经测序和序列分析显示，ORF64全长396bp，编码病毒膜蛋白；ORF65全长444bp，ORF64和ORF65有44个碱基重叠。ORF66全长534bp，编码胸苷激酶(TK)，具有保守的ATP结合位点和细胞中TK特征序列。ORF67全长594bp，编码宿主范围相关蛋白。与GPV参考毒株进行比较，ORF64～ORF67序列仅存在较少差异，核苷酸和氨基酸同源性均较高(93.9～100％)。其中TK与GPV参考毒株同源性96.8～100％，与国内分离株同源性为100％。以上结果表明，GPV AV41与地方分离株有很高的同源性，是构建重组山羊痘病毒基因工程疫苗理想的亲本毒株。在以上研究的基础上，首先构建表达报告基因LacZ的重组山羊痘病毒rAV41-LacZ。先将痘苗病毒晚期启动子P11控制下的LacZ基因表达盒插入到GPV转移载体pTK的Kpn I位点，构建了含报告基因LacZ的转移载体pTK-LacZ。然后，通过脂质体法将pTK-LacZ转染已经感染GPV AV41的犊牛睾丸细胞(bovine testes，BT)细胞，经过连续5轮蓝斑筛选、纯化以及PCR鉴定，获得了一株表达LacZ的重组rAV41-LacZ。将rAV41-LacZ在BT细胞和羔羊睾丸(1amb testes，LT)细胞上连续传25代，并进行PCR检测、病毒滴度测定。结果显示，LacZ基因稳定存在，rAV41-LacZ滴度与亲本毒株相似，表明该重组病毒性状稳定，TK基因缺失对病毒增殖影响不大。在成功构建了表达LacZ的重组病毒rAV41-LacZ之后，以O型FMDV vp1基因作为构建重组病毒的靶抗原，以rAV41-LacZ为亲本毒株，反向蚀斑筛选以除去LacZ基因，获得了表达vp1基因的重组病毒rAV41-VP1。本实验将痘苗病毒早/晚期启动子P7.5控制下的O型FMDV vp1基因表达盒插入到GPV转移载体pTK的Kpn I位点，构建了含vp1基因的转移载体pTK-VP1。以rAV41-LacZ为亲本毒株，脂质体法将pTK-VP1转染BT细胞，经过连续6轮反向蚀斑筛选、纯化，经PCR鉴定获得了一株重组病毒rAV41-VP1。对vp1基因PCR产物进一步测序验证。经Western blot、间接免疫荧光和生长动力学检测，rAV41-VP1感染的细胞可以被Western blot方法检测到VP1蛋白的表达，用FMDV特异性抗体可以检测到rAV41-VP1感染的细胞胞浆内荧光。与疫苗株比较，二者增殖特性无明显差异，在BT和LT细胞上形成的蚀斑大小和形态相同。将rAV41-VP1在BT和LT细胞上连续传12代，并对vp1基因进行PCR检测、病毒滴度测定、Westernblot检测。结果表明，vp1基因稳定表达，rAV41-VP1在BT和LT细胞上的病毒滴度和细胞病变与rAV41-LacZ、GPV-AV41无明显差异，表明vp1基因的插入并没有改变rAV41-VP1在细胞培养中的生长特性，rAV41-VP1保持了亲本毒株的生物学特性，可以作为研制山羊痘基因工程疫苗的候选毒株。