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目的本文通过研究超保守uc.454在肺癌组织及肺癌细胞株中的表达及与临床病理意义以及uc.454的表达对肺癌细胞侵袭迁移的影响,并探讨uc.454对下游靶分子K-RAS调控机制以及其抑制肺癌细胞侵袭迁移的信号通路的研究,旨在为非小细胞肺癌的临床治疗提供实验基础。方法1、应用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法检测非小细胞肺癌细胞系中uc.454的表达,qRT-PCR方法和RNA原位分子杂交方法检测130例NSCLC术后组织标本和90例癌旁正常肺组织中uc.454的表达水平,分析uc.454的表达水平与临床病理参数及预后之间的病理关系。2、建立uc.454过表达/沉默稳定表达的肺癌稳定细胞株,然后在细胞水平上通过划痕实验和Transwell实验来观察uc.454对肺癌细胞侵袭迁移能力的影响。3、通过生物信息学分析K-RAS是uc.454靶基因之一,并证实K-RAS的转录后区域具有uc.454的结合位点。应用uc.454过表达/沉默稳定表达的肺癌细胞株(A549、NCI-H520),通过qRT-PCR和Western Blotting实验检测K-RAS的m RNA和蛋白表达水平的变化,从而了解uc.454能否能直接或间接抑制K-RAS的表达。建立K-RAS转录后区域的野生型和突变型质粒,应用双荧光素酶报告系统,检测uc.454是否通过结合K-RAS的3’UTR抑制K-RAS的蛋白表达。在rescue实验反复验证中,首先使用敲低K-RAS的表达的肺癌细胞,观察对P65/MMP9的信号通路的影响,其次使用uc.454过表达和K-RAS过表达的肺癌细胞株,观察uc.454对P65/MMP9的信号通路的影响。4、查阅文献了解K-RAS调控肺癌细胞侵袭转移的信号通路。应用Western Blotting实验检测uc.454过表达/沉默后的K-RAS相关信号通路关键分子P65蛋白和MMP9蛋白的表达变化,在蛋白质水平上验证uc.454是否对K-RAS、P65、MMP9有抑制作用。通过qRT-PCR实验检测uc.454过表达/沉默后能否影响K-RAS、P65、MMP9的表达变化,从而在RNA水平上验证uc.454对K-RAS、P65、MMP9能否有抑制作用。5.在体内实验中,将uc.454过表达的肺癌细胞,过继输入给裸鼠荷瘤(皮下注射,尾静脉注射),观察对荷瘤裸鼠的肿瘤大小(体积)、重量及肺部的转移情况;同时进行移植瘤HE染色和免疫组化实验在蛋白质水平上验证uc.454能否对K-RAS、P65、MMP9有抑制作用。结果1、qRT-PCR结果显示:非小细胞肺癌细胞系中uc.454的表达明显下调;非小细胞肺癌组织中uc.454的表达明显低于癌旁正常组织,差异均具有显著统计学意义(P<0.01)。uc.454 RNA水平与NSLCL患者吸烟情况、年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤病理分级均无关(P值分别>0.05),与肿瘤TNM分期、淋巴结转移、浸润深度均有关(P值分别<0.05)。2、划痕实验结果表明过表达uc.454后,肺癌细胞划痕间伤口愈合距离百分比明显低于对照组;而抑制uc.454后,细胞划痕间伤口愈合距离百分比明显高于对照组,差异均具有统计学意义(P<0.05)。Transwell实验证明过表达uc.454转染组穿膜迁移的细胞数量明显低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。反之,敲低uc.454转染组穿膜迁移的细胞数量明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。3、通过生物信息学分析uc.454基因序列中含有K-RAS 3’非翻译区(3’Untranslated region,3’UTR)的结合位点。双荧光素酶报告基因分析确认在K-RAS 3’UTR野生型转染组,uc.454高表达可明显抑制相应的荧光活性,而在突变组uc.454未有这种抑制作用。因此uc.454与K-RAS是直接结合,并具有特异性。本研究结合生物信息学分析证实uc.454和K-RAS有直接关联,双荧光素酶报告基因分析确认在非小细胞肺癌中,K-RAS是uc.454直接调控的靶点之一。在rescue实验反复验证中,当敲除uc.454和K-RAS以及过表达uc.454和K-RAS后下游基因P65、MMP9的表达无明显变化。当过表达uc.454后,K-RAS及下游基因P65、MMP9的表达明显下调,当敲低uc.454表达后K-RAS及下游基因后P65、MMP9的表达明显上调。4、在裸鼠的体内实验中,uc.454过表达组肺部转移瘤的数目明显少于对照组。皮下荷瘤实验中,uc.454过表达组肿瘤生长的体积和重量变化不大,HE光镜下显示肿瘤生长稀疏,坏死明显,病理性核分裂像较少。qRT-PCR法显示uc.454过表达后K-RAS、P65、MMP9表达下降,而uc.454敲低表达后K-RAS、P65、MMP9表达升高,证实在RNA水平上uc.454对K-RAS、P65、MMP9的抑制作用。免疫组化实验检测uc.454过表达后,K-RAS蛋白、P65蛋白、MMP9蛋白的表达下调,表明在蛋白质水平上uc.454对K-RAS、P65、MMP9有抑制性调控作用。结论1、uc.454在肺癌组织和肺癌细胞系中低表达,与肿瘤TNM分期、淋巴结转移、浸润深度有关,uc.454显著低表达组的预后明显差于相对高表达组;2、uc.454能抑制肺癌细胞的迁移、侵袭能力;3、在肺癌细胞中uc.454直接结合K-RAS 3’UTR,抑制K-RAS的表达;4、uc.454下调K-RAS表达,抑制P65/MMP9信号通路,从而抑制肺癌细胞的侵袭转移。