研究背景及实验设计 肝纤维化是各种病因引起的慢性肝病重要的病理特征，也是进一步向肝硬化发展的中间环节，是由于各种损伤因子持续作用于肝脏导致肝组织反复出现炎症、变性及坏死等病理过程，并由此引起肝内细胞外基质成分(Extracellular matrix, ECM)异常沉积和肝实质细胞再生障碍进行性加重，最终出现肝纤维化甚至肝硬化。目前对肝硬化尚无有效的治疗手段，故力求在发展为肝硬化之前的肝纤维化阶段预防或阻止疾病的进展是国内外肝硬化防治研究领域的重点和热点。资料表明，在肝脏损伤修复过程中，肝星状细胞(Hepatic Stellate Cell, HSC)被一些可溶性介质和局部细胞外基质的改变所激活，转化为肌成纤维样细胞，它不仅可产生大量的细胞外基质，而且能分泌组织金属蛋白酶抑制物(TIMP)抑制新形成胶原的降解，因此HSC的激活和增殖成为肝纤维化时细胞外基质的主要来源，是肝纤维化发生发展的中心环节。 血小板衍生生长因子(Platelet-Derived Growth Factor, PDGF)是一种炎性因子，由A、B两条肽链组合而成，可表现为AA、BB和AB三种形式。研究表明，在肝纤维化时，纤维间隔和炎症坏死区内，PDGF表达增加(以B链为主)。由于PDGF对HSC有强烈促分裂作用，并有趋化活性，因此PDGF在肝纤维化形成过程中可能起重要作用。肝脏PDGF主要来源于血小板、Kupffer细胞及窦内皮细胞，激活的HSC也可分泌PDGF。 PDGF虽是HSC分裂、增殖最强烈的刺激因子，但其作用依赖于HSC膜上特异受体的表达。PDGF受体由α、β亚单位(表现为αα、ββ、αβ)组成，其中α亚单位可与A、B两条肽链结合，而β亚单位(在间质细胞中特异性表达)仅能结合B链。研究发现，静息状态或正常肝的HSC不表达PDGF受体β亚单位，且对PDGF无反应，HSC激活或肝损伤时PDGF受体β亚单位表达则显著增加，且与HSC增殖同步，而α亚单位却无明显变化，提示PDGF受体β亚单位表达与HSC增殖密切相关。研究表明，PDGF受体β亚单位是PDGF作用于HSC的主要信号转导途径(激 上海第二军医大学博士论文 中文摘要 活的HSC膜上主要表达PDGF受体p亚单位人 PDGF B链通过与 PDGF受体p亚单 位结合，激活磷酯酚肌醇上激酶0I上K），使 HSC发生增殖和趋化。 核酶（iboZyTne，RZ）是一种具有酶活性的NA分子，可序列特异性定点 切割靶NA，阻断有害基因的表达，它的发现为基因治疗提供了新的更具特异性 的手段。运用核酶技术定点切割PDGF受体p亚单位rnRNA，阻断其基因表达，从 而抑制HSC的增殖，是基因治疗肝纤维化的新设想，这在国内外尚属首次。本课 题以PDGF受体p亚单位基因胞外区（因该区人和大鼠的基因同源性达83％，属保 守区域）基因的mRNA为靶RNA，设计、合成能特异性定点切割该靶RNA的锤 头状核酶基因；构建能在＊sC内表达核酶的表达载体；并用L中。忙C枯m＊将该重 组载体导入体外培养的HSC，研究抗PDGF受体p亚单位特异性核酶对HSC生物 学特性的影响，旨在进一步阐明PDGF及其受体p亚单位在肝纤维化发生发展中的 作用，并为肝纤维化的治疗开辟新途径。 实验方法 一．采用 60％四氯化碳（CCI＊皮下注射方法制备肝纤维化大鼠模型，应用免 疫组化方法观察在CCI。注人的2、4、6周时PDGF受体p亚单位、I、Ill型胶原和 。－平滑肌肌动蛋白（a－smooth muscle actin，a－SMA）在肝纤维化组织中的动态表达： 将免疫组化结果半定量后用SAS软件分析肝纤维化过程中PDGF受体p亚单位与1、 Ill型胶原和a－SMA的相关性。 二．应用RTPCR方法扩增出大鼠PDGF受体p亚单位基因特异性CDNA，将 其cDNA片段定向克隆于T载体T7启动子下游，’午标记的体外转录物作为靶 RNA，应用计算机模拟设计并合成针对大鼠PDGF受体p亚单位胞外区不同切割位 点的核酶MI 和RZZ基因，将核酶基因克隆于自我切割核酶载体PI．5的5’．CIS核 酶和了－CIS核酶之间，同样进行’中标记的转录，核酶与靶 RNA按一定比例在一定 条件下进行切割反应后，放射自显影显示结果。 三．构建核酶真核表达载体，用LIPofeCtamin方法转染入HSC，用G418筛选 阳性细胞克隆，在转染核酶组及正常对照组中，分别用免疫细胞化学、Northern blot 和Western blot方法检测细胞PDGF受体p亚单位、I、Ill型胶原和a习MA含量变 2 上海第二军医大学博士论文 中文摘要 化；用四哩盐比色试验（MTT）检测加入一定浓度 PDGF－BB前后细胞增殖的变化： 用流式细胞仪检测细胞周期和凋亡指数的变化；叮陡噎bcridine