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本课题以大鼠急性离散的正常和受损DRG神经元为实验对象,采用穿孔膜片钳方法,给予不同温度刺激,在电流钳记录下,研究单个中型DRG神经元(D=30-40μm)的兴奋性和温度敏感性。通过去极化方波刺激观察到在某一个膜电位水平的细胞的兴奋性和温度敏感性;通过去极化斜波刺激观察在连续变化的膜电位水平下细胞的兴奋性变化。在电压钳记录下,检测神经元的全细胞电流。另外,初步分析了温度敏感性神经元的相关离子通道机制。研究结果主要包括三部分:
第一部分:正常和损伤中型DRG神经元按反应特征分类分类依据:方波和斜波去极化刺激下,放电数目,放电形式和放电频率;SMPO的表现;动作电位首先爆发的位置。方波超极化刺激下,有无反跳动作电位的发生。分别检测131个正常细胞和93个损伤细胞,这些中型细胞直径=30-40μm,根据其反应特征可分为3类:
1.第1类神经元:方波去极化刺激下,细胞只在刺激的起始处爆发单个动作电位;细胞在方波和斜波去极化刺激下均无SMPO;在检测中30/131个正常中型细胞和16/93个损伤中型细胞属于此类。
2.第2类神经元:在方波和斜波去极化刺激下,细胞放电数目多;放电为簇状;具有较高的频率;在一定范围内随着膜电位去极化水平增加,细胞的放电频率也增加;在方波和斜波去极化刺激下,细胞出现簇状、梭形的SMPO;方波超极化刺激下,细胞有反跳动作电位。74/131个正常中型细胞和62/93个损伤中型细胞属于此类,其中损伤模型出现的比例明显高于正常标本。
3.第3类神经元:在斜波去极化刺激下,放电为一短簇,具有较高的频率;方波去极化刺激下,在刺激的起始处首先爆发单个动作电位,放电局限于刺激起始段;该类细胞放电常伴有阻尼或一簇梭形的SMPO。方波超极化刺激下,细胞有反跳动作电位。27/131个正常中型细胞和15/93个损伤中型细胞属于此类。
第二部分:DRG中型神经元对温度变化的反应特征通过温度控制系统,给予不同温度刺激即在20℃,24℃,28℃,32℃,36℃五个温度测量点上,在方波去极化刺激下,观察放电数目、放电频率、放电位置、放电阈电位和SMPO的幅值、产生SMPO的膜电位水平的改变;观察在斜波去极化刺激下,细胞放电数目和频率的改变;并在斜波去极化刺激下,电压钳下全细胞电流的变化。结果如下:1.随温度升高放电数增加的温度敏感性神经元(正向变化温度敏感性神经元):其动作电位数目随温度升高明显增加,表现为温度兴奋性提高,降温后兴奋性又恢复,全细胞电流大小有变化。上述第2类细胞主要表现为正向变化温度敏感性,而这类神经元在正常和损伤模型中所占比例近似。另外,随着温度升高此类细胞的兴奋性反应也完全不同,分别命名为周期节律放电型、非周期节律放电型和幅值衰减放电型。
2.随温度升高放电数减少的温度敏感性神经元(负向变化温度敏感性神经元):其动作电位数目随温度升高明显减少,表现为温度兴奋性降低,降温后兴奋性又恢复,全细胞电流大小有较明显的变化。第2类细胞中少部分神经元表现为负向变化温度敏感性,此类神经元在损伤模型中占的比例较大。
3.温度不敏感性神经元,无论升温或降温刺激,该类细胞的反应性无明显变化,全细胞电流无明显变化。上述第1类和第3类细胞多表现为温度不敏感。中型温度不敏感性神经元在损伤模型中占的比例较小。
第三部分:温度敏感性神经元的离子通道机制选择20℃和32℃两个温度点上,主要观察到Ih电流通道的阻断剂以及辣椒素等对温度敏感性神经元反应性的影响,初步分析了相关的离子通道机制和对辣椒素的反应特性。
主要研究结论:
1.据放电反应特征可将正常或损伤中型DRG神经元分为3种类型。第1类细胞,无SMPO,放电少。第2类和第3类细胞都具有簇状的SMPO,放电频率稳定,对刺激斜率敏感。
2.3类细胞在正常和损伤模型中所占比例有明显的差异:第1类:30/131(22.9%)和16/93(17.2%);第2类:74/131(56.5%)和62/93(66.7%);第3类:27/131(20.6%)和15/93(16.1%)。
3.在20~36℃范围内,正常或损伤中型DRG神经元对温度变化的反应特征分为3种类型。随温度升高放电数明显增加的温度敏感性神经元;随温度升高放电数明显减少的温度敏感性神经元;温度不敏感性神经元。
4.随温度升高放电数明显增加的温度敏感性神经元对温度变化的放电模式可表现为:周期节律放电型、非周期节律放电型和幅值衰减放电型。
5.实验结果初步提示Ih电流可能参与了周期节律放电型的兴奋性改变且它对辣椒素敏感,而非周期节律放电型对辣椒素不敏感。