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研究背景肝癌是病死率最高的恶性肿瘤之一,原发性肝癌是肝癌中最常见的一种,其治疗难度比较大。喜树碱是最常见的治疗肝癌的药物之一,其不良反应表现在多个方面,主要的毒副作用是骨髓抑制和肠道损伤,其中骨髓抑制主要表现为外周血白细胞数量的减少。因此,喜树碱在临床上的应用受到了很大的限制。斑蝥为芫青科昆虫干燥体,斑蝥素来源于中药斑蝥,但由于毒性较大,斑蝥素去除1、2位两个甲基人工合成去甲斑蝥素。去甲斑蝥素具有显著的抗肿瘤作用,也是具有升高白细胞作用的化疗药物。本实验期望通过喜树碱与去甲斑蝥素两药联用减轻喜树碱的骨髓抑制的副作用,为临床治疗提供帮助。研究目的研究去甲斑蝥素(Norcantharidin,NCTD)能否缓解喜树碱(Camptothecin,CPT)用药引起的骨髓抑制。研究方法实验一:通过实验获得喜树碱半数致死剂量值(LD50)首先进行预实验。选择实验研究对象,选择6周龄Balb/c小鼠。喜树碱连续灌胃给药14d,由前期结果得知,喜树碱的大概半数致死剂量,并设计正式的实验,选择五个剂量,灌胃给药时间与之前预实验的相同,用概率单位法,计算出小鼠的半数致死量LD50,并且给出置信区间。实验二:短期喜树碱和去甲斑蝥素联合用药毒副作用实验1,首先取6周龄Balb/c小鼠作为实验对象,以CPTLD50(1 mg·kg-1)灌胃给药,分别给药3,6,9,12,15,18,21,24h后,小鼠摘眼球取血约500μL,上下颠倒混匀,用全自动血细胞分析仪检测白细胞情况。2,由1结果得知,CPT能够降低小鼠外周血白细胞水平,且在给药6h时降低最显著。将balb/c小鼠,分为6组,每组8只,选取灌胃给药6h为时间点,分为对照组:CPT1mg·kg-1 组、NCTD 低剂量(10mg·kg-1)组、NCTD 高剂量(20mg·kg-1)组、CPT 1 mg·kg-1+NCTD 10 mg·kg-1 组和 CPT 1 mg·kg-1+NCTD20mg·kg-1 组,用全自动血细胞分析仪检测白细胞情况。3,按之前分组,选取灌胃给药6h为时间点,将小鼠分为6组,对小鼠进行骨髓中性粒细胞的提取。对细胞进行计数,取1×107个细胞,加入APC-CD11b和PE-Ly6G(Gr-1)抗体,避光常温孵育30 min后,离心去上清,加入抗体后选择500μ1PBS缓冲液将细胞进行重悬,用70μm的滤网对细胞进行过滤,用流式细胞分析结果,检测出中性粒细胞占骨髓细胞的比例。4,按之前分组,选取灌胃给药6h为时间点,经过灌胃给药,将6组小鼠按照常规处死,取出肠道进行病理组织学HE染色。根据染色结果,对比喜树碱和去甲斑蝥素以及联合用药组对这个组织脏器的毒性影响情况,并进行分析。实验三:长期喜树碱与去甲斑蝥素联合用药毒副作用实验设置对照组,将balb/c小鼠,分为6组,每组8只,分为对照组:CPT 1 mg·kg-1组、NCTD 低剂量(10mg·kg-1)组、NCTD 高剂量(20mg·kg-1)组、CPT1mg·kg-1+NCTD 10mg·kg-1组和CPT1mg·kg-1+NCTD20mg·kg-1组。小鼠适应性喂养一周以后,连续灌胃14d,全血分析仪检测白细胞变化。将6组小鼠按照常规处死,取出肠道进行病理组织学HE染色,根据染色结果,对喜树碱和去甲斑蝥素对这个组织脏器的毒性影响情况,并进行分析。研究结果实验结果一实验结果表明,喜树碱给药组中的最小全部致死剂量为2.0mg·kg-1,喜树碱的LD50为1.032 mg·kg-1,95%的可信限(0.813,1.232)。实验结果二1,喜树碱给药后小鼠外周血液白细胞检测结果显示,与对照组相比,CPT给药后6h时白细胞总数降到最低,差异显著(P<0.05)。其中,喜树碱给药6小时后,中性粒细胞和淋巴细胞有显著降低(P<0.05),嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和单核细胞数无显著变化。2,由1结果得知,CPT能够降低小鼠外周血白细胞水平,且在给药6h时降低最显著。因此,本实验选择NCTD与CPT联合用药6h后,检测外周血白细胞数量变化情况。与对照组相比,CPT组的白细胞有显著降低,有意义(P<0.05),其中中性粒细胞有显著降低(P<0.05);与CPT组相比,NCTD低剂量组与NCTD高剂量组白细胞数目显著升高(P<0.01);与CPT组相比,CPT与NCTD低剂量、NCTD高剂量联合用药组,升高白细胞效果明显,差异有统计学意义(P<0.05)。其中中性粒细胞,有显著升高(P<0.05),其他细胞无显著变化。3,CD11b+Ly6G+可以作为外周血与骨髓内成熟中性粒细胞表面的特异性标记。小鼠骨髓中性粒细胞流式分析结果显示,各个组中性粒细胞比例无明显差异,无意义(P>0.05)。4,本实验以药物处理6h后,各组采用HE染色的方法,观察各组肠道病理变化,评估其CTP与NCTD联用是否会增加肠道毒性。结果显示,各组小肠黏膜上皮绒毛结构清晰,绒毛充盈无缺损,且未见炎性细胞浸润。实验结果三本实验对小鼠进行连续灌胃2周,再进行对小鼠白细胞变化检测。实验分组与之前相同,与对照组相比,CPT单独用药组白细胞数目,显著降低(P<0.05),其中中性粒细胞,淋巴细胞数目降低显著,有意义(P<0.05);与CPT组相比,NCTD低、高剂量组以及联合用药组,白细胞均显著升高(P<0.01),其中淋巴细胞升高显著,有意义(P<0.01)。HE染色结果显示,各组肠道并未见炎性细胞浸润。结论实验结果中喜树碱对小鼠白细胞的影响有很大变化的。去甲斑蝥素可减轻喜树碱用药引起的白细胞减少症,并且没有增加其肠道毒性,为临床喜树碱应用,并减轻其毒性提供一定理论参考。