论文部分内容阅读
DEAD-box蛋白质是广泛存在于原核及真核生物体内的一类RNA解旋酶。它参与细胞内很多有关RNA的代谢过程,例如pre-mRNA的剪切,mRNA的细胞外运输,翻译的起始,调控RNA-蛋白质复合物的结构,RNA的降解,细胞器基因的表达,核糖体的生物形成等过程。解旋酶按照其结构功能特点可以被分成若干个超家族,其中DEAD-box RNA解旋酶就属于这些超家族中的超家族Ⅱ。这类家族的DEAD-box RNA解旋酶核心结构域由两个RecA-like结构域组成,并包含进化上保守的motifs,其中一个就是D-E-A-D motif, DEAD-box就是以此命名。这些保守的motifs提供结合ATP以及RNA的位点,从而重构RNA结构或者是由蛋白质-RNA组成的高级复合物结构。研究表明,大肠杆菌中一共有五种DEAD-box RNA解旋酶,它们分别是CsdA,DbpA, SrmB,RhlE以及RhlB。低温下,CsdA和核糖体50S大亚基前体相关联并参与其形成,因此CsdA对大肠杆菌的生存很重要,如果在大肠杆菌中缺失csdA基因,那么50S大亚基不能正常形成,而只是产生40S大小的颗粒,以至于形成装配不正确的50S大亚基。还有研究表明,CsdA可以稳定非正常翻译的mRNA,最近一项研究还表明,rpoS mRNA在低温情况下可以表达出Rpos蛋白质帮助大肠杆菌度过低温环境,而rpoS mRNA的翻译不仅受到sRNADsrA和分子伴侣Hfq的调控,还受到CsdA的影响。csdA基因编码了一个由629个氨基酸残基组成的多结构域蛋白质。序列比对显示CsdA包含了一个由约365个氨基酸残基组成的解旋酶核心结构域和一个很长的C-端附属区。然而,CsdA的整体结构以及它的C-端的延伸区域的组成及功能尚不清楚。这里,我们的研究结果发现,CsdA不仅包含有两个串联的RecA-like结构域,还包含有之前从未报道的二聚体结构域以及RNA结合结构域,我们通过X-射线晶体学以及多维核磁共振(NMR)的方法解析了CsdA各个结构域的结构。我们还综合运用X-射线小角散射的方法(SAXS)以及19F-PRE的方法,研究了CsdA核心结构域在溶液中的构象变化,并搭建了CsdA564 (缺失了C-端尾巴上的65个氨基酸残基)在溶液中包含各个结构域的结构模型。体内体外实验均证实了CsdA的二聚体结构域在维持蛋白质结构稳定上是重要的。ATPase活性实验,解旋酶活性实验以及荧光偏振实验都说明的CsdA的C-端区域,包括二聚体结构域,RNA结合结构域,它们之间的linker以及位于RNA结合结构域后面的65个氨基酸残基的C-端尾巴,它们对于CsdA蛋白质结合RNA是重要的。我们发现CsdA可以与核糖体50S亚基重要组分,23S rRNA上一段包含有可以形成Hairpin92的32ntRNA有强结合能力。我们也发现CsdARBD对于单链G-rich的RNA序列具有较高的亲和力,推测CsdA可能首先通过RBD与单链RNA结合,进而将酶的核心催化中心带到相关部位来解旋双链RNA,该发现增加了RBD作为一个RNA结合结构域结合RNA模式的多样性。