【摘 要】
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研究背景膀胱癌作为常见的泌尿系统恶性肿瘤,其病理变化过程具有复杂、多步骤、多因素的特点,其原因与基因结构改变和表观遗传学研究密切相关。DNA甲基化作为表观遗传学基因修饰的方式之一,参与肿瘤的发生、发展和耐药性形成等过程。DNMT3B作为重要的从头甲基化转移酶,被认为参与膀胱肿瘤起始与进展的调控。RNA干扰技术（RNA interference,RNAi）通过基因沉默,被广泛应用于研究基因功能和疾病
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研究背景膀胱癌作为常见的泌尿系统恶性肿瘤,其病理变化过程具有复杂、多步骤、多因素的特点,其原因与基因结构改变和表观遗传学研究密切相关。DNA甲基化作为表观遗传学基因修饰的方式之一,参与肿瘤的发生、发展和耐药性形成等过程。DNMT3B作为重要的从头甲基化转移酶,被认为参与膀胱肿瘤起始与进展的调控。RNA干扰技术（RNA interference,RNAi）通过基因沉默,被广泛应用于研究基因功能和疾病诊疗中,但少有报告关于采用RNAi技术抑制DNMT3B基因的表达对人膀胱癌细胞生物学行为的影响。此外,上皮-间质细胞转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）指上皮细胞获得间质表型特性的基本形态发生过程,是肿瘤细胞具有侵袭转移能力的重要机制之一。目前关于DMNT3B是否参与调控人膀胱癌细胞侵袭、迁移以及EMT需要系统深入的研究。目的构建DNMT3B基因RNAi慢病毒载体并转染人膀胱癌细胞,观察DNMT3B基因沉默后的膀胱癌细胞侵袭,迁移能力以及EMT特征蛋白表达水平的变化,探讨DNMT3B调控膀胱癌迁移,侵袭以及EMT的作用和机制,为把DNMT3B作为膀胱癌靶向治疗的分子靶点提供实验依据和理论基础,具有重要的临床潜在价值。方法1.选取人膀胱癌EJ细胞和UMUC3细胞,使用含有针对DNMT3B基因的shRNA慢病毒载体转染EJ细胞和UMUC3细胞,构建DNMT3B沉默膀胱癌细胞,称为shRNA组;使用空慢病毒转染EJ细胞和UMUC3细胞作为阴性对照组（NC组）。通过RT-PCR检测shRNA组、NC组DNMT3B mRNA表达水平,评估DNMT3B沉默效率,鉴定稳定转染细胞株。2.利用细胞划痕实验和Transwell细胞实验检测shRNA、NC细胞株迁移,侵袭能力变化;Western Blot检测EMT特征蛋白在shRNA、NC细胞株的表达变化,判断DNMT3B基因沉默对人膀胱癌细胞EMT能力的影响。结果1.RT-PCR结果显示shRNA组与NC组相比,EJ细胞和UMUC3细胞中DNMT3B mRNA表达均受到不同程度的抑制（P＜0.01）,沉默效率分别为56%和48%,从而成功鉴定并获得稳定转染人膀胱癌细胞株。2.细胞划痕实验显示DNMT3B基因沉默后膀胱癌细胞株shRNA组的细胞迁移率较NC组下降（P＜0.05）;Transwell细胞实验显示,DNMT3B基因沉默后的膀胱癌细胞株shRNA组的迁移、侵袭细胞较NC组数量减少（P＜0.01）;Western Blot检测显示DNMT3B基因沉默后膀胱癌细胞中EMT特征蛋白表达水平降低（P＜0.01）。结论RNAi慢病毒载体技术能够有效降低膀胱癌细胞中DNMT3B基因mRNA的表达水平,并且DNMT3B基因沉默抑制了人膀胱癌细胞迁移、侵袭及EMT生物学行为的能力,为膀胱癌基因治疗研究提供了实验依据和理论基础。
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