产耐热漆酶菌株的筛选及培养优化研究

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漆酶(Laccase,ECl.10.3.2)是一类含多个铜原子的氧化还原酶,它能催化多种芳香族化合物发生氧化反应。由于具有相当宽泛的底物专一性和较好的稳定性,作为生物催化剂,漆酶在有毒化合物的降解、生物制浆、生物漂白、芳香化合物转化、生物传感器构建等方面展现了越来越重要的应用价值。   本文采用添加愈创木酚的综合马铃薯固体培养基平板法从广州地区多个不同场所采集的土样中筛选出高效产漆酶菌株,并对所筛得的菌株进行了初步鉴定,对产酶条件、产酶培养基的优化、所产漆酶酶学性质以及所筛得的菌株的生长模型和产酶动力学模型进行了较为系统地研究,结论如下:   1.采集了5份不同来源的土壤样本为菌源,采用愈创木酚为特异性底物双层平板法筛选得到一株酶活较高的菌株Tr0702,经形态学以及生理生化实验,初步鉴定为木霉属(Trichoderma spp.)。   2.通过单因素实验方法,研究了木霉Tr0702摇瓶培养产漆酶的条件。实验结果表明木霉Tr0702产漆酶最适培养条件是:装液量为250mL三角瓶中添加50ml产酶液体培养基,培养温度27℃,培养转速为150rpm,接种量100ul孢子悬液(1.7×106)。   3.通过部分析因实验、快速爬坡实验和响应曲面实验对木霉Tr0702摇瓶培养产漆酶的培养基组分进行了优化研究。实验结果表明木霉Tr0702产漆酶最适产酶培养基成分:可溶性淀粉44.4g/L、吐温(80)9g/L、愈创木酚15.04mmol/L、氯化铵10g/L、微量元素液80ml/L、磷酸二氢钾2g/L、硫酸镁10g/L、氯化钙1g/L、硫酸铜0.023g/L、VBi0.12g/L、初始pH5.5。在最适培养条件下,木霉Tr0702培养43h时能够达到产酶高峰,峰值为50.15U/mL,比培养基优化前提高了26.48%。此时其细胞生长干重也达到了最大值。   4.木霉Tr0702所产漆酶性质的测定结果显示,该漆酶最适催化温度为65℃,并且具有良好的热稳定性。在70℃、80℃的缓冲液中,水浴保温1h,相对酶活残留分别为60%和48%以上。如果反应时间可以控制在60min以内,该漆酶的实际应用反应温度可以达到70℃,特殊情况下也可以在80℃左右使用。该漆酶最适催化pH为3.7,在pH4.5~5.5的醋酸缓冲液中保温1h酶活残余达到90%。此漆酶氧化ABTS的米氏常数Km=0.098mmol/L。Cu2+对菌株Tr0702所产漆酶具有激活效应,而Co2+、Fe3+、Ag+抑制漆酶活性,其中Ag+具有极强的抑制作用。   5.使甩BP神经网络对木霉Tr0702建立了生长模型和产酶动力学模型。经验证网络模型BPTR能够准确的反映该菌盼生长状况,与传统的回归建模方式相比,明显的降低了误差,误差平方和为0.8868×10-3,提高了准确度。
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